噬菌體展示技術(shù)：抗體開(kāi)發(fā)的核心工具與實(shí)操要點(diǎn)

摘要：噬菌體展示技術(shù)是體外發(fā)現(xiàn)抗原特異性抗體的核心平臺(tái)，也是治療性單克隆抗體制備的關(guān)鍵手段。本文從噬菌體展示抗體庫(kù)構(gòu)建的核心要素出發(fā)，解析了天然庫(kù)、合成庫(kù)、半合成庫(kù)的設(shè)計(jì)特點(diǎn)，對(duì)比了固相、液相、細(xì)胞淘選三大策略的實(shí)操差異，還介紹了 NGS 和 AI 技術(shù)對(duì)該技術(shù)的升級(jí)賦能。該技術(shù)已助力 20 款治療性抗體獲批，是抗體藥物研發(fā)中不可替代的工具，也在持續(xù)的技術(shù)迭代中不斷突破局限。

一、抗體與噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)認(rèn)知

抗體是 B 細(xì)胞分泌的抗原結(jié)合蛋白，IgG是研發(fā)中最常用的類型，由重鏈和輕鏈組成，核心的抗原結(jié)合區(qū)為Fv 段，經(jīng)改造可形成 Fab、scFv、單域抗體等片段（圖 1），也是噬菌體展示中主要的表達(dá)形式。其實(shí)，早期雜交瘤技術(shù)制備的鼠源抗體存在免疫原性問(wèn)題，人源化、全人源抗體成為研發(fā)方向，而噬菌體展示技術(shù)能繞開(kāi)動(dòng)物免疫，直接體外篩選全人源抗體。

噬菌體展示技術(shù)由 Smith 于 1985 年首創(chuàng)，后被拓展至抗體庫(kù)研發(fā)，核心用M13 絲狀噬菌體，將抗體片段融合在噬菌體 pIII 蛋白上，實(shí)現(xiàn)表面展示（圖 2A）。經(jīng)淘選、洗脫、擴(kuò)增的循環(huán)過(guò)程（圖 2B），能快速富集高親和力的抗原結(jié)合克隆，整個(gè)篩選過(guò)程約兩周，效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法。

圖1.全長(zhǎng) IgG 與噬菌體展示中常用抗體片段的結(jié)構(gòu)對(duì)比

圖2.M13 噬菌體展示及抗體淘選流程示意圖

二、噬菌體展示抗體庫(kù)構(gòu)建的核心要點(diǎn)

構(gòu)建高質(zhì)量的抗體庫(kù)是篩選有效抗體的前提，核心離不開(kāi)噬菌粒載體、抗體片段格式、讀碼框篩選和有效庫(kù)容量四大要素，每一個(gè)環(huán)節(jié)都直接影響庫(kù)的功能性。

噬菌粒載體是庫(kù)構(gòu)建的載體基礎(chǔ)，包含復(fù)制起點(diǎn)、抗性基因、信號(hào)肽、pIII 基因等元件（圖 3），部分載體引入標(biāo)簽肽和琥珀終止密碼子，能實(shí)現(xiàn)抗體展示與可溶性表達(dá)的切換，不同載體的設(shè)計(jì)各有側(cè)重（表 1）。選對(duì)載體，后續(xù)的表達(dá)和篩選才能更順暢。

圖3.用于抗體片段展示的噬菌粒載體示意圖

scFv 和 Fab 是噬菌體展示中最常用的抗體片段。scFv分子量約 25kDa，組織穿透性好，克隆簡(jiǎn)單，庫(kù)多樣性易提升，但穩(wěn)定性較差，轉(zhuǎn)化為 IgG 后親和力可能下降。Fab保留天然鏈配對(duì)，穩(wěn)定性和溶解性更佳，轉(zhuǎn)化 IgG 后親和力更穩(wěn)定，卻因雙鏈表達(dá)導(dǎo)致克隆復(fù)雜，噬菌體展示效率較低。

表1.本綜述中討論的噬菌體展示庫(kù)中使用的噬菌體mid

讀碼框篩選能剔除庫(kù)中移碼或提前終止的無(wú)效序列，提升功能多樣性。常用的方法有 β- 內(nèi)酰胺酶抗性篩選、Protein A/L 親和純化、標(biāo)簽肽淘選等，不同方法能將有效讀碼框比例提升至 80% 以上，甚至 95% 以上，讓庫(kù)的 “有效價(jià)值” 更高。

抗體庫(kù)的有效容量直接影響篩選到高親和力抗體的概率，人體抗體庫(kù)理論多樣性極高，但實(shí)驗(yàn)中庫(kù)容量達(dá) 10?克隆才適合廣譜抗原篩選，1011 級(jí)別的大庫(kù)能進(jìn)一步提升概率。電穿孔是制備大庫(kù)的關(guān)鍵方法，卻受限于實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)際庫(kù)容量的上限約為 1011 克隆。

三、三類噬菌體展示抗體庫(kù)的設(shè)計(jì)與特點(diǎn)

根據(jù)序列來(lái)源，噬菌體展示抗體庫(kù)主要分為天然庫(kù)、合成庫(kù)、半合成庫(kù)（圖 4），三類庫(kù)的設(shè)計(jì)思路差異顯著，適配的研發(fā)場(chǎng)景也各有不同，沒(méi)有絕對(duì)的優(yōu)劣，只有是否適合具體的研究目標(biāo)。

圖4.噬菌體展示中所用抗體庫(kù)的類型概述

天然庫(kù)由未免疫供體的 B 細(xì)胞 Ig 基因構(gòu)建，序列無(wú)抗原偏向性，能篩選各類抗原的抗體，供體來(lái)源包括外周血、骨髓、脾臟等。這類庫(kù)的優(yōu)勢(shì)是序列接近天然，免疫原性低，但篩選出的抗體親和力多為中等，且部分序列可能對(duì)大腸桿菌有毒性，影響庫(kù)的有效性。

合成庫(kù)通過(guò)人工合成序列構(gòu)建，核心用 TRIM、Slonomics 等技術(shù)對(duì) CDR 區(qū)進(jìn)行多樣化改造，框架區(qū)選用表達(dá)效率高、穩(wěn)定性好的人源保守序列。這類庫(kù)能精準(zhǔn)控制序列組成，剔除不利基序，開(kāi)發(fā)性更佳，還能篩選到納摩甚至皮摩級(jí)親和力的抗體，是目前大庫(kù)研發(fā)的主流方向之一。

半合成庫(kù)融合天然序列和人工改造，多將天然 CDR-H3 序列與人工改造的其他 CDR 區(qū)結(jié)合。CDR-H3 是抗原結(jié)合的核心區(qū)域，天然序列的引入能保留其結(jié)構(gòu)多樣性，人工改造則能優(yōu)化其他區(qū)域的表達(dá)和開(kāi)發(fā)性，兼顧天然性和可控性，也成為治療性抗體篩選的重要庫(kù)型。

四、噬菌體展示的三大淘選策略，各有千秋

淘選是噬菌體展示技術(shù)篩選特異性抗體的核心步驟，根據(jù)抗原呈現(xiàn)形式，分為固相、液相、細(xì)胞淘選三大策略（圖 5），截至 2022 年，20 款獲批的噬菌體展示來(lái)源治療性抗體，均由這三類策略篩選得到（表 3）。

圖5.噬菌體展示中固相、液相、細(xì)胞淘選策略的對(duì)比

表3.噬菌體展示來(lái)源的治療性抗體及其淘選方法

固相淘選是最常用的方法，將抗原包被在塑料載體上與噬菌體庫(kù)孵育，操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高，還能實(shí)現(xiàn)高通量篩選，適合重組蛋白、多肽等抗原。但抗原固定過(guò)程可能導(dǎo)致構(gòu)象扭曲，表位被遮蔽，尤其不適合跨膜蛋白等對(duì)構(gòu)象敏感的抗原。

液相淘選將生物素化的抗原與噬菌體庫(kù)在溶液中孵育，再用鏈霉親和素磁珠捕獲抗原 - 噬菌體復(fù)合物。抗原在溶液中保持天然構(gòu)象，表位可及性更高，篩選的抗體親和力往往更好，卻需要額外的抗原標(biāo)記步驟，操作更復(fù)雜，也難以實(shí)現(xiàn)高通量。

細(xì)胞淘選用表達(dá)天然抗原的細(xì)胞作為篩選靶點(diǎn)，抗原保持生理構(gòu)象和翻譯后修飾，能篩選到識(shí)別天然表位的功能性抗體，尤其適合膜蛋白靶點(diǎn)。但細(xì)胞表面雜蛋白多，背景噪音高，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，還需要穩(wěn)定的抗原表達(dá)細(xì)胞系，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求更高。

五、新技術(shù)加持，噬菌體展示技術(shù)的升級(jí)方向

傳統(tǒng)噬菌體展示篩選依賴單克隆挑取和 ELISA 驗(yàn)證，通量低，還容易因大腸桿菌擴(kuò)增偏倚丟失低豐度高親和力克隆，而 NGS 和 AI 技術(shù)的融入，讓這項(xiàng)技術(shù)的篩選效率和庫(kù)設(shè)計(jì)能力實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的提升。

NGS能對(duì)淘選各輪的噬菌體庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，一次性分析數(shù)百萬(wàn)條序列，精準(zhǔn)追蹤序列的富集趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法遺漏的低豐度克隆。結(jié)合 ATTILA、PSERM 等生物信息學(xué)工具，還能從序列中挖掘抗原結(jié)合的關(guān)鍵基序，讓篩選從“憑運(yùn)氣”變成“有依據(jù)”。

AI則主要賦能抗體庫(kù)的設(shè)計(jì)和候選抗體的開(kāi)發(fā)性評(píng)估。AI 能基于海量抗體序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)出表達(dá)效率高、穩(wěn)定性好的合成庫(kù)，還能通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和機(jī)器學(xué)習(xí)，提前評(píng)估候選抗體的聚集、溶度、翻譯后修飾風(fēng)險(xiǎn)，在篩選早期剔除開(kāi)發(fā)性差的克隆，減少后續(xù)研發(fā)的失敗率。

六、噬菌體展示技術(shù)的現(xiàn)狀與局限

坦白講，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成為抗體藥物研發(fā)的核心工具之一，憑借體外篩選、無(wú)需動(dòng)物免疫、速度快的優(yōu)勢(shì)，成功助力 20 款治療性抗體獲批，還能篩選到毒性抗原、自身抗原等傳統(tǒng)方法難以靶向的抗體，填補(bǔ)了研發(fā)的空白。

但這項(xiàng)技術(shù)也并非完美，體外篩選缺乏體內(nèi)親和力成熟過(guò)程，初始抗體的親和力可能偏低。原核表達(dá)系統(tǒng)與真核系統(tǒng)存在差異，部分抗體的表達(dá)和修飾難以模擬體內(nèi)狀態(tài)；庫(kù)容量、淘選過(guò)程的抗原構(gòu)象問(wèn)題，也依然是研發(fā)中需要攻克的難點(diǎn)。

其實(shí)，隨著庫(kù)設(shè)計(jì)的優(yōu)化、淘選策略的創(chuàng)新，以及 NGS、AI 等新技術(shù)的深度融合，噬菌體展示技術(shù)的這些局限正被逐步打破。未來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)還會(huì)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的背景下，繼續(xù)為高特異性、高親和力、高開(kāi)發(fā)性的治療性抗體研發(fā)提供核心支撐，成為抗體藥物研發(fā)中不可或缺的工具。

參考資料：

http://www.biomolther.org/journal/DOIx.php?id=10.4062/biomolther.2025.158

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