Vita丨黨波波團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)可突破同手性識別規(guī)則的天然真核蛋白酶

2026年4月20日，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西湖實(shí)驗(yàn)室黨波波教授團(tuán)隊在Vita發(fā)表題為Transcending Stereochemical Boundaries: Ambidextrous Cleavage of D- and L-Peptide Enantiomers by Natural Eukaryotic Proteases的研究論文，突破蛋白質(zhì)同手性識別這一傳統(tǒng)認(rèn)識原則，首次發(fā)現(xiàn)天然真核蛋白酶同時具有“同手性”和“異手性”識別催化能力，高效切割相同序列的L-型及D-型多肽底物，并為精準(zhǔn)治療、診斷和分子工程提供了新的機(jī)遇。

生物體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)與多肽幾乎均由 L-型氨基酸構(gòu)成，其分子間相互作用通常遵循同手性識別原則。基于此，天然蛋白酶能夠高效識別并切割 L-型多肽底物，而難以作用于其鏡像形式的 D-型多肽；尤其在真核生物中，由于 D-型氨基酸極少參與天然生命過程，天然蛋白酶通常被認(rèn)為缺乏對 D-型底物的識別與催化能力。這一認(rèn)識構(gòu)成了 D-型多肽具有高穩(wěn)定性、強(qiáng)抗降解性并可用于藥物開發(fā)的重要理論基礎(chǔ)，也間接導(dǎo)致了近年來對于鏡像生命體系可能帶來生物安全的擔(dān)憂。

然而，這一長期被接受的傳統(tǒng)認(rèn)知，雖與既有實(shí)驗(yàn)觀察總體一致，并在領(lǐng)域內(nèi)被廣泛沿用，但對于天然真核蛋白酶是否對 D-型底物完全缺乏識別和切割能力，仍缺少系統(tǒng)性的直接檢驗(yàn)。針對這一問題，本研究聚焦天然真核蛋白酶對底物手性的選擇規(guī)律，系統(tǒng)探索天然真核蛋白酶是否存在對兩類對映體底物兼容識別與催化的能力及其分子基礎(chǔ)，旨在挑戰(zhàn)“天然真核蛋白酶不能識別和切割 D-型多肽”這一經(jīng)典觀點(diǎn)，推動對生命體系手性識別規(guī)律的重新認(rèn)識，并為 D-型多肽藥物設(shè)計及鏡像生物分子的生物學(xué)效應(yīng)評估提供新的理論依據(jù)（圖1）。

圖1. 蛋白質(zhì)的同手性識別與異手性識別原則示意圖

研究團(tuán)隊通過構(gòu)建包含多種D-型氨基酸的組合多肽庫，經(jīng)多輪系統(tǒng)性篩選與序列優(yōu)化，成功鑒定出針對人組織蛋白酶 B （ hCATB ）、木瓜蛋白酶（ Papain ）和小鼠羧酸酯酶 1c （ mCES1c ）等天然真核蛋白酶的高活性D-型多肽底物。酶學(xué)動力學(xué)分析顯示，木瓜蛋白酶、 hCATB 及mCES1c對其優(yōu)選D-型多肽底物的催化效率（ k cat / K m 值 ）分別達(dá) ( 2. 4 ± 0. 5) × 10 3 M -1 s -1 、(4.6 ± 0. 6) × 10 4 M -1 s -1 及(5.7 ? 0.6) ? 10 3 M?1 s?1 ，該效率與 TEV蛋白酶、HRV3C蛋白酶等 常用工具酶相當(dāng)甚至更優(yōu) ，充分 證實(shí) 了 這類天然真核蛋白酶具備 高效的異手性催化能力 。 同時， 實(shí)驗(yàn)證實(shí)三種蛋白酶 對對應(yīng) 的 L- 型多 肽底物 同樣保持 高催化活性， 明確驗(yàn)證了其雙 手性底物識別與催化 的獨(dú)特 功能。

為闡明蛋白酶雙手性識別的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊成功解析了 hCATB 與 D- 型五肽（ ?rkyyG? ）、 L- 型三肽（ ?YYG? ）底物的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)（ PDB: 9XHR 、 9VA8 ），發(fā)現(xiàn) D- 型與L - 型多肽分別結(jié)合于 hCATB 活性口袋的不同區(qū)域，通過形成數(shù)量不同的氫鍵及構(gòu)象適配實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定結(jié)合（圖2）。

圖2. hCATB對D-/L-型多肽底物的穩(wěn)定結(jié)合、高效水解

為進(jìn)一步闡明動態(tài)識別機(jī)制，研究團(tuán)隊對hCATB、木瓜蛋白酶及mCES1c與手性底物的相互作用進(jìn)行了分子動力學(xué)（MD）模擬。結(jié)果顯示，hCATB與 ?rkyyG? 、 ?YYG? 的結(jié)合均保持穩(wěn)定；木瓜蛋白酶對L-/D-型多肽的識別依賴 π-π 堆積作用，二者結(jié)合于同一口袋但構(gòu)象不同；mCES1c則通過C端氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定L-型多肽，通過與Glu228的鹽橋作用結(jié)合D-型多肽，呈現(xiàn)出獨(dú)特的不對稱結(jié)合模式。這些結(jié)果表明，天然蛋白酶的手性識別機(jī)制具有系統(tǒng)特異性，是口袋可塑性與底物構(gòu)象靈活性共同作用的結(jié)果。

在應(yīng)用轉(zhuǎn)化層面，研究團(tuán)隊基于篩選獲得的hCATB特異性D-型多肽底物成功開發(fā)出新型 ADC 可裂解連接子，并將其分別與曲妥珠單抗、抗 CLDN18.2 抗體偶聯(lián)，構(gòu)建出高均一性的 ADC 。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類 ADC 能特異性靶向結(jié)合 HER2 陽性或 CLDN18.2 陽性腫瘤細(xì)胞，殺傷活性與對照ADC（Val-Cit連接子）相當(dāng)；體內(nèi)腫瘤異種移植模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示， D -型多肽連接子 ADC 可有效抑制腫瘤生長，部分模型實(shí)現(xiàn)腫瘤完全緩解，療效優(yōu)于對照 ADC ，這一優(yōu)勢可能源于 D -型多肽連接子更優(yōu)異的的小鼠血漿穩(wěn)定性。該研究為解決傳統(tǒng)ADC存在的脫靶毒性、代謝穩(wěn)定性不足等關(guān)鍵問題提供了新技術(shù)路徑，展現(xiàn)出良好的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

該研究發(fā)現(xiàn)天然真核蛋白酶可識別并高效切割相同序列的L-/D-型多肽底物，拓展了對蛋白酶特異性的認(rèn)知，證實(shí)特定場景下“雙手性”識別的存在。這為理解生物分子相互作用提供了新視角，其機(jī)制可能與分子識別起源或潛在進(jìn)化相關(guān)，也為蛋白酶抑制劑、生物探針、肽基材料及前藥連接子等研究與應(yīng)用奠定了新基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)價值與轉(zhuǎn)化前景。

原文鏈接：https://www.vita-journal.com/vita/EN/10.15302/vita.2026.03.0022

制版人： 十一

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