這 9 種流式圖怎么看，轉給那個看不懂的師妹（自己）

師妹給我發來一張流式圖：「師兄，我的 FSC-SSC 里細胞全在左下角，是不是跑光了？」我一看，那是典型的碎片+死細胞 —— 她忘了第一道門。

流式細胞術的圖不難認，難的是：拿到圖之后不知道該看哪里、門怎么圈。下面直接上干貨 —— 9 個常見實驗場景，一張圖一個解法。

插個題外話，下期想看看什么，告訴我唄

FSC-SSC 散點圖

（按照細胞大小和類型分群）

X：FSC（前向角散射）：反映細胞大小，信號越強細胞體積越大。

Y：SSC（側向角散射）：反映細胞內部顆粒度 / 復雜度，信號越強顆粒越多。

是所有后續分析的「第一道門」，用于去除碎片、粘連體并初步分群。

淋巴細胞：FSC 小、SSC 小（左下群）

單核細胞：FSC 中、SSC 中（中間群）

粒細胞：FSC 中、SSC 大（右上群）

碎片/死細胞：FSC 極小、SSC 極低（最左下）

圖 1: 源自丁香園

• FSC-A vs FSC-W：去除粘連細胞（僅保留對角線的單細胞群）。

• SSC-A vs SSC-W：同理，用于顆粒度高的樣本（如粒細胞）去粘連。

單參數熒光直方圖

X：熒光強度（線性 / 對數軸），反映目標分子表達水平

Y：細胞數量，反映各熒光強度對應的細胞數。

圖 2: 源自丁香園

圖形特征

解讀

應用場景

單峰靠左

陰性表達（無目標分子）

同型對照、未染色對照

單峰靠右

均一陽性表達（如 CD45 在白細胞的表達）

細胞系標記驗證

雙峰分布

部分呢陽性、部分陰性表達（如 CD3 在 T 細胞中的表達）

免疫細胞亞群分群

寬峰/彌散峰

表達不均一、非特異染色或凋亡細胞

凋亡早起檢測

Sub-G1 峰

（最左側小峰）

凋亡細胞（DNA 片段化）

細胞凋亡定量分析

雙參數熒光圖：散點圖 / 密度圖 / 等高線圖

1. 雙參數散點圖

橫、縱坐標各代表一種熒光標記，將細胞分為四個象限

左上（Q1）：X- Y+

右上（Q2）：雙陽性（共表達）

左下（Q3）：雙陰性

右下（Q4）：X+ Y-

2. 密度圖 / 偽彩圖

圖 3：源自普拉特澤生物官網

用顏色深淺表示細胞密度，適合展示稀有細胞亞群。優勢：比散點圖更易識別細胞群邊界，減少噪音干擾。

3. 等高線圖

圖 4：源自普拉特澤生物官網

用等高線勾勒細胞密度分布，清晰區分彌散亞群。適用場景于細胞數量少、亞群分散的樣本（如外周血稀有細胞）。

設門系列圖

一級門（P1）：FSC-SSC 圈活細胞、去碎片

活力染料門（PI/7-AAD/Zombie）

• 陰性峰：活細胞

• 強陽性峰：死細胞

譜系/次級門（如 CD3→CD4/CD8→ 亞群）

凋亡分析（Annexin V-FITC / PI）

Q1：左上為早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）

Q2：右上為晚期凋亡細胞（Annexin V+/PI+）

Q3：右下為細胞核碎片或機械損傷細胞（Annexin V-/PI+）

Q4：左下為正常（活）細胞（Annexin V-/PI-）

圖 5：小編自己的

細胞周期

G0/G1：2N DNA，主峰

S 期：兩峰之間（DNA 復制中）

G2/M：4N DNA，G1 右側約 2 倍強度

圖 6：小編自己的

細胞增殖（CFSE 稀釋法）

每分裂 1 次，熒光強度減半

峰越右：未分裂/少分裂

峰序列左移：第 1、2、3… 代

可算增殖指數、分裂次數、增殖率

圖 7：源自百螢生物官網

特殊應用圖

1. 調節性 T 細胞（Treg）分析圖

典型方案：CD4+CD25+Foxp3+

圈門流程：淋巴細胞 → CD3+ → CD4+ → CD25/Foxp3 雙參數圖。

右上雙陽群為 Treg 細胞，需使用 FMO 對照消除非特異染色。

圖 8：小編自己的

2. 胞內細胞因子染色（ICS）圖

用于檢測活化 T 細胞分泌的細胞因子（如 IFN-γ、IL-2、TNF-α）。

示例：CD8+ vs IFN-γ 雙參數圖中，右上雙陽群為抗原特異性 CTL 細胞。

對照圖的重要性

1. 未染色細胞對照

確定細胞自發熒光基線，設置陰性門位置。

2. 同型對照（Isotype）

使用與一抗同物種、同亞型的非特異性抗體，排除非特異性結合。

3. FMO 對照（Fluorescence Minus One）

多色流式必備：僅缺少目標熒光通道的染色管，用于精準圈定弱陽群。

4. 單陽管對照

用于調節熒光補償，消除熒光通道間的光譜重疊。

補償異常表現：細胞群傾斜、跨象限、拖尾。

常見異常圖形及問題排查

異常表現

可能原因

解決辦法

細胞群整體傾斜

熒光補償未調節好

重新設置單陽管，調節補償矩陣

細胞呈線狀/拖尾

電壓過高、死亡細胞過多

降低通道電壓、優化樣本制備

邊界截斷層

細胞信號超出量程

降低對應通道電壓

大量彌散點

碎片多、死亡細胞過多

優化裂解、固定步驟，試用活力染料

雙峰粘連

未去除細胞粘連體

使用 FSC-A/FSC-W 設門

1. 細胞群整體傾斜 → 重新設置單陽管，調節補償矩陣：熒光補償不當時，陽性群與陰性群在雙參數散點圖中呈斜向分布（非垂直或水平），需通過單陽性對照計算溢出系數（Spillover Coefficient）。

專業步驟：

• 制備高質量單陽管：分別使用各熒光染料的單染細胞（或補償微球），確保陽性群熒光強度與實驗樣本相近。避免使用強表達抗原的細胞，以免補償過度。

• 采集單陽數據：保持電壓與實驗管完全一致，記錄每個單陽管的各通道熒光強度。

• 自動/手動調節：

自動補償：在軟件（如 FlowJo、Diva、Kaluza）中加載所有單陽管與陰性管，執行自動補償計算。

手動調節：以 PE-A vs FITC-A 為例，調整 PE-%FITC，使 FITC 單陽管的 PE 中位數值與陰性管相同。

• 驗證補償矩陣：將補償應用于混合染色樣本，檢查雙陽性細胞群是否與坐標軸平行。若仍傾斜，需重新調節補償或檢查是否存在光譜重疊未完全校正（如 PE-Cy5 與 APC）。

常見誤區：

• 使用死細胞或聚集細胞制備單陽管，導致非特異性熒光。

• 補償矩陣應用于不同電壓設置的樣本，需保持電壓恒定。

2. 細胞呈線狀/拖尾 → 降低通道電壓、優化樣本制備：線狀拖尾通常源于電壓過高導致信號飽和（進入非線性區），或死細胞自發熒光及非特異性染色。降低電壓可恢復信號線性；優化樣本制備減少死細胞。

專業步驟：

• 電壓調整 ：

用陰性細胞（未染色）調節 FSC/SSC 電壓，使細胞群位于坐標軸中央（通常 FSC 閾值設為 200-500）。

對熒光通道，使用單陽管或微球（如 Rainbow、CST beads）調至目標熒光強度（PE 通道峰值約 10^4 AU）。若出現拖尾，逐步降低電壓 5-10%，直至群形緊湊。

• 優化樣本制備：

減少機械應力：使用鈍頭移液槍頭，避免反復吹打。

加入活力染料（如 7-AAD、PI、DAPI）排除死細胞，并在分析時設門排除。

若為組織樣本，改用溫和酶消化（如 DNase I + 膠原酶 IV）替代胰酶。

固定后離心速度降低至 300 g，4℃，10 分鐘，避免死細胞破裂。

• 檢測后驗證 ：重新上樣，觀察 FSC-A/SSC-A 圖中細胞群是否呈緊湊橢圓形，且熒光散點圖拖尾消失。

3. 邊界截斷層 → 降低對應通道電壓：細胞信號超出檢測器量程時，細胞群在散點圖邊緣被「切斷」，導致數據丟失。常見于高表達抗原或高自發熒光樣本。

專業步驟

• 識別過壓通道：查看單參數直方圖，若峰形在最大道數處突然截止，即為飽和。

• 逐步降壓 ：

將對應光電倍增管（PMT）電壓每次降低 20-30 V（或 5-10%），直至所有細胞落在坐標軸內。

使用質控微球（如 Sphero Rainbow）驗證線性范圍，確保弱陽性群仍可分辨。

• 替代方案：若降低電壓后弱陽性信號過低，可改用低靈敏度檢測模式（如對數放大器）或稀釋樣本。

• 記錄變更：調整后需重新設置補償和閾值，并在實驗記錄中注明電壓值，確保批次間可重復。

注意事項：

邊界截斷層也可能由閾值（Threshold）設置不當引起，需檢查 FSC 閾值是否過低導致電子噪聲飽和。若降壓后仍截斷，應檢查 PMT 或更換儀器通道。

4. 大量彌散點 → 優化裂解、固定步驟，使用活力染料：彌散點通常對應碎片（FSC 小、SSC 低）或死細胞（非特異性染色強）。優化裂解和固定可減少碎片產生，活力染料則能直接排除死細胞干擾。

專業步驟：

• 裂解步驟優化：

改用低滲透壓裂解液（如 ACK、BD Pharm Lyse）按 1:10 比例室溫裂解 5-8 分鐘，避免超時。

裂解后立即加入含 2% FBS 的 PBS 終止反應，離心（400 g，5 分鐘）后棄上清。

避免渦旋震蕩，改用輕柔顛倒混勻。

• 固定步驟優化：

固定液濃度降至 1-2% 多聚甲醛（PFA），4℃ 固定 15 分鐘，隨后用含 0.5% BSA 的 PBS 洗滌兩次。

若檢測胞內抗原，固定后用 0.1% 皂素或 Triton X-100 打孔，時間控制在 10 分鐘內。

• 活力染料應用：

推薦使用胺基反應性死活染料（如 Live/Dead Fixable Blue、Zombie NIR），可固定且兼容胞內染色。

染色方案：樣本重懸于 PBS，加入 1?μL 染料/100 萬細胞，室溫避光 15 分鐘，洗滌一次后再進行表面染色。

分析時在散點圖中對死活染料陰性（活細胞）設門，可顯著減少彌散點。

• 碎片去除：若碎片仍多，可在洗滌后使用密度梯度離心（如 Ficoll-Paque）或商業碎片去除試劑盒（如 Dead Cell Removal Kit, Miltenyi）。

5. 雙峰粘連 → 使用 FSC-A/FSC-W 設門：細胞粘連體（雙聯體或多聯體）在流式檢測中會產生異常的雙峰或拖尾，影響細胞周期、倍體分析及免疫分型。FSC-A（面積）與 FSC-W（寬度）聯合設門可有效排除粘連體。

• 正確設門順序 ：

先對 FSC-A / SSC-A 圈出主要細胞群。

新建散點圖：X 軸為 FSC-A，Y 軸為 FSC-W（或 FSC-H）。

正常單個細胞具有固定的 FSC-W 與 FSC-A 比值，呈對角線分布；粘連體因通過檢測點時寬度增大，FSC-W 相對偏高，偏離對角線。

圈出對角線上緊湊區域（通常設門比例在 80-95%），即為單細胞。

• 替代參數：也可使用 FSC-H vs FSC-A，單細胞呈線性關系（斜率 ≈1），粘連體偏離。

• 驗證：對于 DNA 倍體分析，建議同時使用 PI 染色，并在 FL2-A vs FL2-W 圖中再次設門，排除粘連體。

• 注意事項：

確保儀器參數中已啟用 FSC-W 或 FSC-H 檢測（某些低端流式儀需手動開啟）

若樣本中粘連體過多，可在制備時加入 DNase I（10?μg/mL）并過 40?μm 濾網。

設門后應回看 FSC-A/SSC-A 圖，確認單細胞群形態緊湊。

• 進階技巧：對于粘連體比例極高的樣本（如貼壁細胞），可改用 FSC-H vs FSC-A 聯合 SSC-H vs SSC-A 雙參數設門，提高排除效率。

編輯：冷漠小 z

題圖來源：自制