《食品科學》：南京農業大學孫健教授等：基于超聲輔助酶解技術的大豆抗氧化肽制備、活性評價及分子機制

大豆因蛋白含量高、氨基酸組成均衡、功能特性好以及致敏性低等特點，被聯合國糧食及農業組織列為21世紀最具開發潛力的植物蛋白之一。然而，我國大豆加工業長期面臨“高產量、低附加值”的產業困境，約80%的加工產品仍停留在豆油、豆粕等初級形態，其蛋白質資源利用率不足40%。隨著社會經濟的不斷發展，深度開發大豆蛋白活性肽等具有高附加值的產品成為突破產業瓶頸的重要路徑。

抗氧化肽通過酶解、微生物發酵、化學合成以及天然提取等方法釋放，具有抗氧化、抗高血壓及免疫調節等多元生物活性，能夠作為合成添加劑的天然替代品，在功能性食品、醫用營養品及運動補充劑等領域展現出了廣闊的應用前景。近年來，隨著健康意識的提升和生物技術的發展，各種蛋白抗氧化肽的研究逐漸受到重視。分子對接是一種理論模擬方法，可用于研究蛋白質、多肽或其他生物分子與靶點之間的相互作用機制。通過分子對接分析，可以預測抗氧化肽與自由基或相關靶點的結合模式、結合位點以及結合強度，從而揭示其抗氧化活性的分子機制。謝晉祥等研究發現，經模擬胃腸消化后3 種核桃小分子多肽組分含量增高，其2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）陽離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率均有所上升，人體必需氨基酸含量上升，且與抗氧化相關的氨基酸含量較高。Xu Yue等對大豆分離蛋白（SPI）水解物的結構特征、抗氧化活性和降血糖活性進行分析，并對其生理活動進行綜合評價，結果表明堿性酶水解物表現出最大的生物活性。Zheng Zhaojun等通過響應面法優化酶水解雞血細胞水解條件，獲得制備最強抗氧化活性水解液的最佳條件，使用液相色譜電噴霧電離串聯質譜鑒定得出具有最高抗氧化活性的肽序列，并進一步證明了其作為抗氧化成分的潛力。Sun Jin等分離純化了6 個新肽并進行鑒定，篩選出具有最強抗氧化能力的肽，確定DTYIRQPW和WDDMEKIWHH為主要的抗氧化肽，能夠保護HepG2細胞免受H2O2誘導的氧化損傷，分子對接結果表明分離肽的抗氧化特性與氫鍵的位點和數量有關。

目前，肽主要通過酶解法獲得。蛋白酶的水解條件簡單可控，不產生有害副產物，是一種特異性高、不使用有機溶劑、作用條件溫和、環保且高效的方法，但該工藝存在酶成本高、水解時間長、收率低等缺點，已不能滿足工業高效生產的需要。為了解決此類問題，可以引入一定的輔助手段（如超聲波和超高壓等物理預處理方法）提高酶解效率和多肽得率。與傳統的酶促水解相比，超聲波輔助水解可以破壞蛋白質二級結構之間的化學鍵（如氫鍵），使蛋白質結構疏松、多孔，產生空化效應，加速底物與蛋白酶之間的水解反應，不僅能夠縮短反應時間，還能提高酶利用率和底物轉化率。王立等研究發現，與常規酶解相比，超聲輔助酶解制備的鵝肝多肽抗氧化性顯著提高。Magalh?es等研究表明，與常規酶解相比，超聲輔助酶解顯著提高了羊奶酪蛋白水解速率和抗氧化肽的產生速度。此外，相對于超高壓法，超聲波預處理的技術適配性更高、成本更低、實操性更強，因此本實驗選擇超聲波預處理輔助酶解。

安徽糧食工程職業學院的林曉華，新疆農業大學食品科學與藥學學院的馬欣，南京農業大學食品科學技術學院的孫健*等以SPI為原料，運用超聲波輔助酶解技術制備大豆抗氧化肽，通過測定DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率等多種方法評價所得多肽的抗氧化活性，分析其氨基酸組成，揭示肽段分子質量分布與抗氧化活性的構效關系，以期為大豆蛋白資源的高值化利用提供理論與技術支撐，并為功能性食品和營養補充劑中天然抗氧化劑的開發奠定技術基礎。

01

抗氧化活性分析

體外抗氧化活性的測定是分析蛋白質及多肽抗氧化能力的重要手段。多肽一般指分子質量＜10 kDa、由10～100 個氨基酸殘基組成的線性或簡單構象片段，無完整空間結構，功能以生物活性調節為主；蛋白質通常分子質量＞10 kDa，由≥100 個氨基酸殘基組成，具備二級及以上復雜空間結構（如α-螺旋、β-折疊構成的三級/四級結構），承擔催化、結構支撐等核心生理功能。如圖1A所示，＜3 kDa的小分子多肽DPPH自由基清除率較高，隨著質量濃度增加，清除率迅速上升并趨近于較高水平，3～10 kDa多肽次之，＞10 kDa蛋白組分清除率最低。如圖1B所示，＜3 kDa和3～10 kDa多肽ABTS陽離子自由基清除率隨質量濃度增加的上升速率高于＞10 kDa蛋白組分，能夠在較低質量濃度下達到較高的清除水平。如圖1C所示，＜3 kDa的小分子多肽羥自由基清除能力高于3～10 kDa多肽和＞10 kDa蛋白組分，能夠有效抑制羥自由基引發的氧化損傷。如圖1D所示，各組樣品FRAP均隨樣品質量濃度增加而逐漸上升，＜3 kDa小分子多肽FRAP最強，＞10 kDa蛋白組分最弱。

在4 種抗氧化實驗中，3 組不同分子質量的大豆蛋白酶解液抗氧化活性由高到低依次為＜3 kDa、3～10 kDa、＞10 kDa。這與Je等研究發現多肽分子質量在500～1 800 Da具有較強的抗氧化活性結論一致。＜3 kDa小分子肽段自由基清除率高主要是因為其分子質量小、結構簡單，內部活性基團易暴露，從而易與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基結合并將其清除，表現出較強的抗氧化活性；而＞10 kDa蛋白組分空間結構更加復雜，活性基團多被包裹在分子內部，難以與自由基充分接觸并發生反應，導致抗氧化活性受限。除此之外，小分子多肽的分子構象相對簡單，在溶液中具有更高的靈活性和擴散性，能夠更快速地與自由基相遇及碰撞，反應速率更快；相比之下，大分子多肽的分子構象較為剛性，擴散速度慢，與自由基的反應效率低，進而影響其抗氧化活性。部分抗氧化多肽可通過絡合金屬離子（如Fe2+、Cu2+等）抑制其催化產生自由基，從而發揮抗氧化作用，小分子多肽由于結構簡單，活性基團暴露充分，在與金屬離子絡合時具有更強的親和力和絡合能力，能夠更有效地降低金屬離子的催化活性，減少自由基的產生；而大分子多肽因活性基團包裹及空間位阻，絡合金屬離子的能力較弱，抗氧化效果相對較差。

因此，在多種抗氧化活性評價體系中，分子質量分布對多肽抗氧化活性具有重要影響，小分子質量多肽的抗氧化活性更強。這與Jiménez-Ruiz和Wen Chaoting等的研究結論一致。

02

氨基酸組成分析

由表1可知，大豆酶解液中具有豐富的氨基酸組成，包含17 種氨基酸。在所有肽段樣品中，谷氨酸（Glu）的含量占比相對突出，分別為（6.74±0.12）%、（5.40±0.11）%、（4.95±0.05）%，其次是半胱氨酸（Cys）、賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）等，這與大豆蛋白的原始氨基酸組成以及水解氨基酸種類密切相關。大豆蛋白中各類蛋白的氨基酸構成特性，決定了酶解產物的基礎氨基酸分布，其中谷氨酸作為大豆蛋白中常見且含量豐富的氨基酸，在酶解后仍保持較高占比。堿性蛋白酶作為水解酶有利于提取疏水性氨基酸，如Ala、Val、Leu、Pro、Phe和Met等。成分組成中亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸及芳香族氨基酸含量較高，使酶解液具有良好的抗氧化活性。

從＜3 kDa到＞10 kDa，隨著肽段分子質量增大，可觀察到抗氧化氨基酸總量呈下降趨勢（＜3 kDa為（21.24±0.32）%，3～10 kDa為（20.52±0.27）%，＞10 kDa為（17.68±0.45）%），＜3 kDa肽段的氨基酸總量高于3～10 kDa和＞10 kDa，表明小分子肽段中氨基酸釋放更充分，這可能是由于酶解對小分子肽的作用更徹底，更易產生游離氨基酸。抗氧化氨基酸（如Cys、Tyr等）是維持機體氧化-還原平衡的重要物質，其在小分子肽段（＜3 kDa）中相對富集，能夠使該分子質量區間肽段展現出更優的抗氧化潛力。同時，疏水性氨基酸總量也隨分子質量增大而降低（＜3 kDa為（21.32±0.53）%，3～10 kDa為（20.95±0.10）%，＞10 kDa為（18.80±0.26）%），這與本實驗研究所得的＜3 kDa組別的抗氧化活性高于其他兩組的實驗結果相印證，驗證了部分疏水性氨基酸與肽的抗氧化活性具有相關性 。這種分布特點，使＜3 kDa肽段在功能活性發揮上更具優勢，為大豆酶解產品在功能食品開發等方向提供了應用依據。

03

分子質量分布分析

將從大豆酶解液超濾分離得到的組分進行LC-MS/MS檢測，鑒定其蛋白質及多肽組成。在該組分中共鑒定出218 組蛋白質（分子質量＞10 kDa），1 217 條唯一性肽段（分子質量＜10 kDa）。大豆酶解液的質譜基峰圖如圖2所示。

由圖3A可知，1 000～1 500 Da的肽段含量最高，有519 條，占比高達42.60%，說明酶解過程傾向生成該分子質量區間的肽段；1 500～2 000 Da的肽段有359 條，占比29.50%，也相對突出；500～1 000 Da的肽段有32 條，占比2.60%；而3 000 Da以上的肽段有6 條，僅占比0.50%。這表明該大豆酶解液組分中分子質量均較小，分子質量分布主要集中在1～2 kDa之間，反映出堿性蛋白酶酶解對大分子肽段的降解作用顯著，小分子肽段成為主體。分子質量小于3 kDa的低聚肽具有較好的抗氧化活性，活性基團更容易暴露于分子外部，易與結合位點相互作用。因此，推測制備的大豆多肽擁有較好的抗氧化作用。

如圖3B所示，大豆酶解液所得肽段長度主要分布在5～25 個氨基酸殘基之間，其中肽段長度10～15 個氨基酸殘基的有676 條，占比達55.5%，是最主要的肽段長度分布區間；長度在5～10、15～20、20～25 個區間的肽段分別占12.0%、16.9%、15.5%，整體呈現以中短肽段（尤其是10～15 個氨基酸殘基）為主的分布規律。結果表明，大豆蛋白經酶解后，在特定酶作用與反應條件下，更易產生分子質量集中于1 000～2 000 Da區間、長度以10～15 個氨基酸殘基為主的肽段，此類中短小分子肽段的大量存在，既與酶解對蛋白的特異性切割有關，也為后續探究大豆酶解液的功能活性（如抗氧化、營養特性等）提供了物質基礎。

04

肽段篩選

為明確大豆酶解液中肽段的生物活性，對鑒定出的1 217 條肽段開展多維度篩選。首先借助Peptide Ranker網站進行潛在生物活性預測（分值0～1分，分值越高活性潛力越好），經篩選，0.90 分以上肽段有17 條、0.80 分以上111 條、0.70 分以上215 條。隨后，選取≥0.70 分的215 條肽段進一步分析：通過AnOxPePred在線軟件預測其自由基清除能力與金屬離子螯合能力，利用ToxinPred工具預測毒性，同時計算疏水性氨基酸比例。綜合各項評分，最終篩選出10 條最優肽段用于后續分子對接實驗，結果如表2所示。

從活性評分看，這些肽段均具有較高的活性評分（均大于0.90 分），DVWDPFHGFPG的活性評分最高，為0.971 分，反映出這些肽段在生理活性層面具備潛力。Yesiltas等研究表明，在抗氧化肽序列評分中，潛在自由基清除能力結果得分范圍一般在0.30～0.60之間，潛在金屬離子螯合能力得分范圍一般在0.10～0.30之間，該范圍內的肽段通常在后續實驗中具有良好的抗氧化活性，篩選出的10 條肽段自由基清除能力評分與金屬離子螯合能力評分均在該范圍內，說明肽段在抗氧化體系中可有效清除自由基，具有結合金屬離子的潛力。肽段毒性預測結果均為Non，表明10 條肽段均無毒性，為其后續應用奠定了安全基礎。10 條肽段的疏水性氨基酸比例均大于50%，APPAIPLPPPPL的疏水性氨基酸比例最高，達100%。當肽段中疏水性氨基酸的比例適當時，能夠達到較好的抗氧化效果，此時，肽段既能保持合適的空間結構以發揮抗氧化作用，又能保證在溶液中的溶解性，便于與氧化物質充分接觸；若疏水性氨基酸比例過高，可能導致肽段溶解度降低，影響其在體內的吸收和分布，進而降低抗氧化活性；而比例過低，則可能無法形成有利于抗氧化的空間結構，同樣不利于抗氧化作用的發揮。篩選出的大豆酶解液肽段經評估具有良好的潛在生物活性，如抗氧化、自由基清除等能力，作為配體與Keap1蛋白進行對接，有望揭示肽段在抗氧化通路中的作用機制，挖掘其作為功能性成分應用于疾病預防或治療等領域的潛力。

05

分子對接分析

分子對接是基于結構藥物設計的核心模擬手段，通過計算機模擬技術，預測受體（如蛋白質）與配體（如小分子化合物、肽段等）之間的結合模式和親和力。Keap1蛋白是細胞內抗氧化反應的關鍵調控蛋白，在氧化應激響應中扮演核心角色，與多種疾病的發生發展相關，以其為受體進行研究能深入探究抗氧化等生理過程。

將篩選出的10 條肽段與Keap1蛋白進行分子對接，所得結合能如表3所示。ALPAPPMPGMGGF的結合能最低，為-9.7 kcal/mol，顯示出最強的結合能力；而DFPALSWLRL的結合能最高，為-7.2 kcal/mol，結合能力相對較弱。分子對接結果表明，不同肽段與Keap1蛋白的結合能力存在顯著差異，結合能的高低不僅反映了肽段與Keap1蛋白之間的親和力強弱，還可能與其潛在的抗氧化活性密切相關，結合能越低，與靶標蛋白的相互作用越強，抗氧化能力越突出。

將結合能力最強的3 條肽段（ALPAPPMPGMGGF、APPAIPLPPPPL、TSLDFPALSWLRLS）與Keap1蛋白結合的分子對接結果通過PyMOL軟件生成3D相互作用圖，LigPlus軟件生成2D分子相互作用圖。如圖4所示，可以更直觀地觀察到肽段與Keap1蛋白之間的關鍵結合位點及相互作用類型，3 條多肽均與Keap1蛋白的活性口袋形成了氫鍵及疏水作用力。

肽段主要通過氫鍵、疏水作用與Keap1蛋白的關鍵氨基酸殘基形成穩定結合。ALPAPPMPGMGGF多肽的結合能最低，其與Keap1蛋白的Val463、Ile559、Val606、Val369、Thr560、His516和Val512氨基酸殘基形成了10 個氫鍵，與Gly564、Val514、Val561、Leu365、Leu557、Gly603、Gly464、Ala556等23 個氨基酸殘基形成了疏水相互作用。氫鍵與疏水作用多重相互作用進一步增強了結合的穩定性。APPAIPLPPPPL和TSLDFPALSWLRLS也表現出較強的結合能力，其結合能分別為-9.5 kcal/mol和-9.3 kcal/mol。APPAIPLPPPPL多肽與Keap1蛋白的Ile559、Val465、Val467、Arg470氨基酸殘基形成了5 個氫鍵，與Leu365、Ala366、Val604、Val606、Ile559和Gly605氨基酸殘基形成了疏水相互作用。TSLDFPALSWLRLS多肽與Keap1蛋白的Asn414、Arg415、Ile416、Val418、Val465、Val467、Ser555、Val514與Val608氨基酸殘基形成了14 個氫鍵，與Cys434、Ile461、Gln530、His436、Phe478、Tyr334、Ser602等34 個氨基酸殘基形成了疏水相互作用。這些肽段在結合過程中依賴于多種分子間作用力，尤其是疏水性氨基酸的比例較高時，能夠顯著增強與Keap1蛋白的疏水作用，從而提升整體結合強度。

分子對接分析揭示了大豆酶解液中篩選出的肽段與Keap1蛋白之間的結合特性及其潛在機制。結合能較低的肽段表現出更強的靶向結合能力，并可能通過調控Keap1-核因子E2相關因子2通路發揮抗氧化作用，這一結果為后續實驗驗證及應用研究奠定了堅實基礎。

結 論

本研究通過超聲輔助酶解技術制備了大豆蛋白抗氧化肽，并系統評價了其抗氧化活性及分子機制。在最優工藝條件下，將酶解液進行超濾分組并測定其抗氧化活性，結果表明分子質量＜3 kDa多肽表現出最強的自由基清除能力和FRAP，其抗氧化活性顯著高于3～10 kDa多肽和＞10 kDa蛋白組分。氨基酸組成分析顯示，小分子肽段中疏水性氨基酸和抗氧化氨基酸含量較高，與其抗氧化活性高密切相關。通過LC-MS/MS鑒定出1 217 條唯一性肽段，從其中篩選出10 條高活性肽段（如ALPAPPMPGMGGF、APPAIPLPPPPL等），分子對接結果顯示這些肽段與Keap1蛋白具有較高的結合親和力，結合能最低為-9.7 kcal/mol，主要通過氫鍵和疏水作用發揮抗氧化活性。本研究可為大豆蛋白的高值化利用提供理論依據和技術支撐，同時可為功能性食品和營養補充劑中天然抗氧化劑的開發奠定基礎。

本研究也存在一定的局限性：一是僅采用體外抗氧化評價體系，未開展動物或人體體內實驗，無法明確肽段在生物體內的吸收、分布、代謝規律及體內抗氧化效果；二是分子對接基于單一Keap1靶點，未考慮肽段與體內其他抗氧化相關蛋白的相互作用，且未對結果進行可行性驗證，可能存在作用機制的片面性；三是工藝優化僅針對實驗室規模，未進行中試放大實驗，酶成本控制、連續化生產流程等工業化應用問題尚未解決。

未來可從以下幾個方面繼續推進研究：開展小鼠體內實驗，結合血清代謝組學探究肽段體內活性及吸收代謝途徑；開展體外、細胞實驗及抗氧化協同實驗，驗證肽段與Keap1蛋白的結合作用及對相關通路的調控效果，同時利用蛋白質組學等技術篩選潛在靶點，構建完整抗氧化作用網絡；優化中試工藝，探索酶固定化技術降低成本，開發大豆抗氧化肽的功能性食品原型；通過磷酸化等修飾手段，提升肽段穩定性、生物利用度及抗氧化性能。

作者簡介

通信作者：

孫健，教授，南京農業大學食品科學技術學院黨委書記。研究方向：肉制品加工與質量控制。

教育經歷：

2007.9-2011.6，南京農業大學 食品科學 工學博士學位；

2001.9-2004.7，南京農業大學 食品科學 工學碩士學位；

1994.9-1998.7，南京農業大學 食品科學與工程 學士學位；

工作經歷：

2020.5-至今，南京農業大學食品科技學院，黨委書記；

2014.1-2020.5，南京農業大學資產管理與后勤保障處，處長；

2013.1-2013.12，南京農業大學研究生院招生辦公室，主任；

2009.11-2013.1，南京農業大學食品科技學院，黨委副書記；

科研工作：

主持、參與國家自然基金面上項目4 項、十四五國家重點研發計劃子課題1 項、國家自然基金青年項目1 項、國家科技支撐計劃項目2 項，以及其他多個重點科研項目，以第一作者、通信作者包括共同通信作者身份在國內外知名刊物Food Hydrocolloids、Food Chemistry等期刊發表論文40多篇，獲得專利授權3項。

教學工作：

承擔了《食品市場營銷》《食品產業市場營銷》等本科生、研究生課程。指導省級SRT項目1 項，國家級SRT項目1項。所在團隊“肉品加工與質量控制創新團隊”獲得農業部“神農中華農業科技獎優秀創新團隊獎”，南京農業大學優秀導師團隊。先后獲得了江蘇省大中專志愿者暑假“三下鄉”社會實踐優秀指導教師、校優秀團干部、校社會實踐優秀指導教師、校優秀學生教育管理工作者、優秀共產黨員、江蘇省優秀黨務工作者等榮譽稱號。

第一作者：

林曉華，安徽糧食工程職業學院講師，中共黨員，高級農產品食品檢驗員，2013年9月畢業于南昌大學發酵工程專業，獲工學碩士學位。2014年2月至2016年2月在上海青瑞食品科技有限公司從事研發工作，2016年9月在安徽糧食工程職業學院食品生物系工作至今，主要研究方向為食品生物技術。

先后主持院級重點項目1 項，安徽省級課題2 項，同時參與多項省、院級課題建設。在《中國食品》《現代食品》《信陽農林學院學報》等國家級期刊上發表論文多篇，參編高職高專教材1 本。指導學生在各類創新創業大賽上榮獲國家級一等獎1 項，省級一等獎1 項，二等獎5 項，三等獎4 項，榮獲優秀指導教師2 項。

引文格式：

林曉華, 馬欣, 史東紅, 等. 基于超聲輔助酶解技術的大豆抗氧化肽制備、活性評價及分子機制[J]. 食品科學, 2026,47(2): 250-258. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250813-094.

LIN Xiaohua, MA Xin, SHI Donghong, et al. Preparation, activity evaluation and molecular mechanism of antioxidant soybean peptides by ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis[J]. Food Science, 2026, 47(2): 250-258. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250813-094.

實習編輯：南伊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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