《食品科學(xué)》：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林曉蓉副教授等：南昆山毛葉茶關(guān)鍵呈澀多酚的鑒定及呈澀效應(yīng)分析

茶（Camellia sinensis (L.) O. Kuntze）起源于中國，是廣受全球消費者喜愛的健康飲料。咖啡堿是茶葉三大活性成分之一，但過量攝入容易引起失眠、焦慮、心悸等副作用，限制了敏感人群的日常飲用。近年來，隨著新式茶飲行業(yè)的飛速發(fā)展，茶葉消費市場不斷擴大，消費者對低咖啡堿茶產(chǎn)品的需求日益增長。南昆山毛葉茶（C. ptilophylla）是我國特有的天然低咖啡堿、且可供飲用的珍稀茶樹，不僅減少了咖啡堿的中樞神經(jīng)興奮作用，而且具有比傳統(tǒng)茶樹（C. sinensis）更強的抗氧化、抗炎、抗癌活性和降血糖活性，素有“百歲茶”之美譽。然而，由于南昆山毛葉茶澀感突出，消費者接受度較低，市場推廣嚴(yán)重受阻。

茶葉的呈澀過程是茶多酚與口腔黏膜上皮細(xì)胞或唾液蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞收縮、拉扯或形成局部皺褶，刺激機械信號傳導(dǎo)，其中，茶多酚與唾液蛋白的相互作用對澀感的形成、發(fā)展和感知至關(guān)重要。兒茶素約占茶多酚的70%，是茶葉中最重要的呈澀多酚，其酯型/非酯型、焦酚型/兒茶酚型、順式/反式等結(jié)構(gòu)差異均會導(dǎo)致呈澀強度的差異。與傳統(tǒng)茶樹高順式/低反式的兒茶素組成相比，南昆山毛葉茶的兒茶素中反式構(gòu)象占比更高（89%），且含有1,2,4,6-四沒食子酰葡萄糖（1,2,4,6-GA-glc）、沒食子兒茶素-3,5-雙沒食子酸酯（GC-3,5-diGA）等特殊多酚。這種獨特的茶多酚組成可能是南昆山毛葉茶澀感突出的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，但具體的呈澀多酚及其呈澀效應(yīng)尚不明確。

基于此，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院的嚴(yán)毅鵬、李斌、林曉蓉*等以南昆山毛葉綠茶（CP）為主要研究材料，以云南大葉種綠茶（CS）為傳統(tǒng)茶樹對照，采用感官審評和人工唾液濁度法比較兩種綠茶的呈澀強度，利用高效液相色譜（HPLC）分析兩種綠茶主要多酚組分與人工唾液的結(jié)合率，初步篩選主要呈澀多酚，采用熒光光譜分析各呈澀多酚與人工唾液模型蛋白的相互作用，并結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-QOrbitrap HRMS）系統(tǒng)分析茶湯與人工唾液結(jié)合前后的代謝組差異，篩選并鑒定差異化合物，旨在為深入闡釋南昆山毛葉茶的呈澀機理奠定前期基礎(chǔ)，為這一珍稀低咖啡堿茶樹資源的提質(zhì)增效和開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1 兩種綠茶呈澀強度比較

為評價南昆山毛葉綠茶的呈澀強度，首先采用感官審評結(jié)合半舌稀釋法分析兩種綠茶的呈澀閾值，發(fā)現(xiàn)CP的呈澀TD值（256）遠(yuǎn)大于CS（70.4）（數(shù)據(jù)未列出），說明CP的澀感更強。進而，采用AS結(jié)合濁度法及熒光光譜法分析兩種茶湯對AS的濁度和熒光猝滅的影響，發(fā)現(xiàn)兩種綠茶與AS混合后體系濁度均顯著增大，但CP茶湯稀釋128 倍仍能顯著增大體系濁度，而CS茶湯稀釋32 倍時，體系濁度無顯著變化（圖1A）；兩種綠茶與AS混合后體系熒光強度均顯著降低，且CP對AS的熒光猝滅率均高于CS（圖1B），說明CP與AS的結(jié)合能力更強。上述結(jié)果表明，南昆山毛葉綠茶的澀感顯著強于云南大葉種綠茶。

2 兩種綠茶主要呈澀多酚篩選

為初步篩選南昆山毛葉茶主要呈澀多酚，采用HPLC測定茶湯與AS混合孵育前后主要多酚組分的濃度，計算并比較各組分的結(jié)合率，結(jié)果如表1所示。CP的GCG、EGCG、EC、GC、EGC、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA以及CS的EGCG、GCG、GC、ECG、CG與AS的結(jié)合率均大于50%，可能在兩種綠茶呈澀過程中發(fā)揮重要作用。在CP中，反式兒茶素（GCG、GC、CG）的質(zhì)量濃度及其與AS的結(jié)合率普遍高于其順式構(gòu)象（EGCG、EGC和CG）；在CS中，順式兒茶素EGCG、ECG和EC的質(zhì)量濃度及AS結(jié)合率均高于其反式構(gòu)象（GCG、CG和C），說明濃度效應(yīng)是決定這些兒茶素與AS結(jié)合率的重要因素。然而，CP中EGCG、EC、GC、EGC的質(zhì)量濃度顯著低于CS，但在CP中與AS的結(jié)合率卻更高或相當(dāng)，提示不同茶湯中同一組分與AS的結(jié)合作用存在差異。研究表明，果膠等多糖能夠與唾液蛋白競爭結(jié)合多酚，鈣離子可通過“橋連”作用增強多酚與唾液蛋白的結(jié)合，說明茶湯其他成分可能參與茶多酚與唾液蛋白的相互作用，從而對其呈澀產(chǎn)生復(fù)雜的調(diào)控作用。

3 南昆山毛葉茶主要呈澀多酚的呈澀效應(yīng)

為進一步探究CP主要呈澀多酚與唾液蛋白的相互作用，首先采用典型呈澀多酚——單寧酸為模型，分別與AS中含量較高的4 種蛋白質(zhì)（α-淀粉酶、BSA、乳鐵蛋白和溶菌酶）混合孵育，采用熒光光譜比較分析其熒光猝滅率，篩選合適的唾液蛋白模型，結(jié)果如圖2A所示，單寧酸對BSA的最大熒光猝滅率最高，達(dá)到81.1%，顯著高于α-淀粉酶（59.4%）和乳鐵蛋白（51.6%），對溶菌酶的最大熒光猝滅率最低（僅為35.8%），表明BSA與單寧酸的結(jié)合作用最強，可作為唾液蛋白模型。

以BSA為模型，以單寧酸為對照，比較上述11 種茶多酚單體對BSA的最大熒光猝滅率（圖2B），發(fā)現(xiàn)兩種綠茶主要多酚對BSA的最大熒光猝滅率均低于單寧酸，其中以GCG、1,2,4,6-GA-glc、GA-3,5-diGA的猝滅率最高，其次是酯型兒茶素CG、EGCG、ECG，非酯型兒茶素GC、EGC、C、EC和GA等猝滅率較小；在8 種兒茶素單體中，酯型＞非酯型，反式＞順式，焦酚型＞兒茶酚型。

為探究多酚與BSA結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系，以GCG、EGCG、GC、1,2,4,6-GA-glc、GC-3,5-diGA為研究對象，以單寧酸為對照，采用熒光光譜分析不同濃度（0～10 μmol/L）多酚與BSA混合孵育前后的熒光光譜，計算分析多酚與BSA相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。由圖3可知，在加入6 種多酚單體后，BSA在330 nm波長處的熒光特征峰熒光強度均明顯減弱，且隨多酚濃度升高，熒光強度逐漸降低，表明多酚與BSA的結(jié)合導(dǎo)致后者空間構(gòu)象改變，內(nèi)源性熒光基團被掩蓋或結(jié)合。由表2可知，Kq均大于最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)（2.0×10 10 L/（mol·s）），說明6 種多酚對BSA的熒光猝滅類型主要為靜態(tài)猝滅。在310 K條件下，6 種多酚與BSA的結(jié)合位點數(shù)均在1左右，表明這些多酚物質(zhì)與BSA至少通過一個位點結(jié)合；各多酚與BSA的結(jié)合親和力強弱依次為單寧酸＞GCG＞GC-3,5-diGA＞EGCG＞1,2,4,6-GA-glc＞GC。反式兒茶素GCG與BSA的結(jié)合親和力強于其順式構(gòu)象EGCG，酯型兒茶素GCG、EGCG與BSA的結(jié)合親和力強于非酯型GC。熱力學(xué)分析結(jié)果顯示，6 種多酚與BSA結(jié)合過程的ΔH和ΔS均為正值，ΔG均為負(fù)值，表明這些多酚與BSA結(jié)合主要通過自發(fā)的疏水相互作用實現(xiàn)。這與Li Min等研究一致，即酯型兒茶素EGCG對BSA的熒光猝滅作用強于非酯型兒茶素EGC，EGCG主要通過其沒食子酰基結(jié)合于BSA亞結(jié)構(gòu)域IIA和IIIA之間的疏水口袋深處。Xiao Jianbo等關(guān)于兒茶素與人和鼠血清蛋白的相互作用研究均表明，反式構(gòu)象更有利于兒茶素與血清蛋白結(jié)合。

多酚-蛋白相互作用包括多位點疏水相互作用和氫鍵。進一步采用分子對接預(yù)測各多酚單體與蛋白的氫鍵相互作用，分析其最小能量結(jié)合模式和對接結(jié)合能，并以PyMOL軟件進行可視化處理，結(jié)果見表3和圖4。通常認(rèn)為，分子對接結(jié)合能小于-5 kcal/mol時，小分子配體與大分子之間具有較強的親和力。如表3所示，6 種呈澀多酚與BSA的最小對接結(jié)合能和平均對接結(jié)合能均明顯小于-5 kcal/mol，說明各多酚與BSA的氫鍵相互作用較強，且結(jié)合親和力大小順序為單寧酸＞GC-3,5-diGA＞1,2,4,6-GA-glc＞GCG＞EGCG＞GC，即沒食子酰基、反式構(gòu)象有利于多酚與BSA的氫鍵結(jié)合。

由圖4可知，BSA的ASP-517、GLN-521、THR-518、GLN-403、ARG-427、SER-428、ARG-185、LYS-114、LEU-115、HIS-145、LEU-112、ASP-111、GLU-424、PRO-420共14 個氨基酸殘基參與其與單寧酸的相互作用；LEU-112、ASP-111、LYS-114、GLU-424、ARG-427、GLU-186、ARG-185、ARG-144、LEU-115共9 個氨基酸殘基參與結(jié)合1,2,4,6-GA-glc；ARG-185、LEU-115、ARG-144、ASP-111、LEU-112共5 個氨基酸殘基參與結(jié)合EGCG；ARG-185、HIS-145、LEU-115、LEU-112共4 個氨基酸殘基參與BSA和GCG、GC-3,5-diGA的相互作用，ARG-185參與BSA與GC的相互作用。可見，沒食子酰基有利于兒茶素與BSA形成更多氫鍵。

綜上，GCG、1,2,4,6-GA-glc、GA-3,5-diGA、EGCG是CP最主要的4 種呈澀多酚，不僅含量高，且與唾液蛋白的結(jié)合親和力強，以疏水相互作用為主、氫鍵為輔結(jié)合唾液蛋白。

4 基于HRMS挖掘和鑒定兩種綠茶的呈澀多酚

上述研究重點關(guān)注CP中含量較高的呈澀多酚，為進一步挖掘其他呈澀多酚單體，采用HRMS比較分析兩種綠茶與AS結(jié)合前后的代謝物組成，利用Compound Discoverer軟件中的非靶向代謝組學(xué)分析工作流，結(jié)合本地OTCML數(shù)據(jù)庫和自建數(shù)據(jù)庫以及mzCloud在線數(shù)據(jù)庫進行化合物檢索，在4 組樣本中共檢測到1 548 個化合物特征碎片離子，鑒定到197 種代謝物。

進而對4 組樣品的代謝物進行PCA和聚類熱圖分析。由圖5可知，QC樣本在PCA圖中聚集情況良好，主成分可解釋4 組樣本62.16%的差異，樣品組存在顯著的代謝物多樣性。由圖6可知，不同生物學(xué)重復(fù)間聚成一簇，而不同組別中代謝物組成具有明顯差異，說明與AS結(jié)合顯著改變了兩種綠茶代謝物的響應(yīng)。代謝物共分為3 簇：簇I以煙酸、2,4-二氨基甲苯、高瓜氨酸為代表，在兩種綠茶與AS結(jié)合后的上清液中響應(yīng)強度較高，說明這些代謝物與AS結(jié)合作用弱；簇II以甜菜堿、綠原酸、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、咖啡堿為代表化合物，在CS中響應(yīng)值較高，且CS與AS混合孵育后，上清液中該簇代謝物的響應(yīng)值降低，提示了這些化合物可能是CS參與結(jié)合AS的主要代謝物；簇III以山柰酚、可可堿、大黃素、花旗松素為代表化合物，在CP中響應(yīng)值較高，且在CP與AS結(jié)合后響應(yīng)值明顯降低，說明這些代謝物與AS結(jié)合率較高。

在此基礎(chǔ)上，利用OPLS-DA對兩種綠茶與AS結(jié)合前后的代謝物進行成對分析，4 組樣本、2 個比較組模型中Q 2 均大于0.9，且驗證圖中左側(cè)所有藍(lán)色Q 2 點均低于最右側(cè)原始藍(lán)色Q 2 點，表明所構(gòu)建模型高度可靠（OPLS-DA圖未列出）。進而分析各代謝物的變量投影重要性（VIP），并在mzCloud、OTCML數(shù)據(jù)庫和自建數(shù)據(jù)庫鑒定的基礎(chǔ)上，篩選同時滿足log 2 差異倍數(shù)（FC）＞1、P＜0.05、VIP＞1的化合物為關(guān)鍵差異代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CP與AS結(jié)合后相對豐度降低的代謝物有35 種，F(xiàn)C達(dá)到2 倍以上的代謝物有24 種，且以多酚物質(zhì)為主，其中，花旗松素和楊梅素的相對豐度FC均超過100 倍，ECG、大黃素、EGC、異綠原酸B等多酚物質(zhì)的相對豐度FC均超過5 倍（圖7）；CS與AS結(jié)合后相對豐度降低的代謝物有36 種，F(xiàn)C超過2 倍的代謝物有25 種（以上數(shù)據(jù)未列出），其中多酚物質(zhì)共13 種，楊梅素和ECG的FC超過100 倍，其次是大黃素、花旗松素、柚皮素查耳酮、異綠原酸B和EGC（圖8）。綜上，花旗松素、楊梅素、大黃素等多酚可能是兩種綠茶的呈澀多酚。

進而利用熒光光譜法分析楊梅素、大黃素和花旗松素對AS的熒光猝滅率，并與其他兒茶素單體進行對比，楊梅素、大黃素對AS的熒光猝滅率（43.85%、39.99%）均高于GCG（33.43%），花旗松素（30.22%）對AS的熒光猝滅作用同樣強于EGCG（26.91%），說明這3 種多酚同樣是兩種綠茶的重要呈澀多酚。目前，楊梅素已被證實是傳統(tǒng)綠茶重要的呈澀多酚，但大黃素和花旗松素的呈澀作用仍需驗證。

5 結(jié) 論

本研究通過感官審評結(jié)合人工唾液模型證實了南昆山毛葉茶突出的呈澀強度，利用HPLC結(jié)合熒光光譜、分子對接篩選了GCG、EGCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA等主要呈澀多酚，并證實其通過以疏水相互作用為主、氫鍵結(jié)合為輔的模式與唾液蛋白模型BSA結(jié)合；結(jié)合基于HRMS的非靶向代謝組學(xué)，進一步篩選了楊梅素、大黃素、花旗松素等呈澀多酚。未來可在此基礎(chǔ)上，利用口腔細(xì)胞模型、唾液摩擦學(xué)等多角度分析南昆山毛葉茶主要呈澀多酚的呈澀機理，探索茶湯其他組分對主要呈澀多酚呈澀效應(yīng)的影響，為解決南昆山毛葉茶澀味突出這一技術(shù)難題提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

引文格式：

嚴(yán)毅鵬, 李斌, 龔興鑫, 等. 南昆山毛葉茶關(guān)鍵呈澀多酚的鑒定及呈澀效應(yīng)分析[J]. 食品科學(xué), 2026, 47(2): 152-161. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250731-247.

YAN Yipeng, LI Bin, GONG Xingxin, et al. Identification and astringent effects of key astringent polyphenols in Camellia ptilophylla tea[J]. Food Science, 2026, 47(2): 152-161. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250731-247.

實習(xí)編輯：甘冬娜；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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