獸用 mRNA 疫苗平臺

事實證明，疫苗接種是控制動物病原體的有效手段。自 19 世紀引入獸用疫苗以來，已開發出幾代疫苗。這些疫苗對全球動物健康和生產產生了積極影響。盡管獸用疫苗取得了成功，但仍有一些病原體尚無有效的疫苗，例如非洲豬瘟。此外，動物健康不斷受到新出現和重新出現的病原體的威脅，其中一些是人畜共患的，可能對人類健康構成威脅。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2) 大流行凸顯了對安全有效的新疫苗平臺的需求，但同樣重要的是，這些疫苗平臺應具有適應性，可以快速修改以匹配傳播的病原體。mRNA疫苗已被證明是針對各種病毒和細菌病原體的有效疫苗平臺。本文將介紹獸用 mRNA 疫苗領域的一些最新進展。此外，本文還將討論各種mRNA疫苗及其遞送方法，以及已報道的療效。此外，本文還將討論該疫苗平臺在獸醫領域的當前局限性和未來前景。

簡介

新發和復發的病毒性疾病導致大流行的持續威脅日益加劇。COVID-19 疫情凸顯了對可放大、快速開發且低成本疫苗的迫切需求，以控制未來的衛生緊急情況。mRNA疫苗有可能適應最新傳播的病毒變異株。與傳統疫苗相比，mRNA疫苗的這一特性使其成為控制可能引起流行病或大流行的新興病毒的更佳候選疫苗。

誘導持久的細胞和抗體介導的免疫反應對于有效控制新發病原體至關重要。mRNA 的給藥會導致抗原的短期產生及其在細胞質中聚集。與自然感染類似，抗原肽被轉運至有核細胞表面，由主要組織相容性復合體(MHC)-I 分子呈遞。該胞質途徑可誘導細胞毒性 T 淋巴細胞(CTL)。另一方面，編碼抗原的分泌和循環利用會激活MHC-II 通路。

mRNA 被遞送至常規細胞（例如肌肉細胞）后，會通過核糖體直接翻譯成蛋白質（抗原）。這些蛋白質經過蛋白酶體加工，然后裝載到細胞表面的 MHC-I 上、進行膜錨定，或釋放到細胞外空間。肽在MHC-I 上的呈遞會激活CD8 + T 細胞。分泌到細胞外或進行膜錨定的病毒蛋白會被 B 細胞感知，并引發抗體依賴性應答。在吸收分泌的病毒蛋白后，肽會通過 MHC-II 呈遞到抗原呈遞細胞(APC) 上。該途徑將觸發 CD4 + T 細胞應答，這對于啟動抗體介導的應答也至關重要（圖 1）。

圖 1. 細胞攝取后包裹 mRNA 的 LNP 的細胞內通路示意圖。注射后，(1) LDL 受體通過 ApoE脂蛋白與 LNP 相互作用。然后，顆粒停留在內體中 (2)，由于 pH 值下降，陽離子脂質帶電，這有助于破壞內體膜。然后，核糖體開始翻譯mRNA 分子并產生病毒抗原(3)。病毒抗原通過蛋白酶體降解(4)，MHCI 分子將表位呈遞給 CD8+ T 細胞 (5)。病毒抗原也可以由 MHC II 分子呈遞以激活 CD4+ T 細胞(6)。完整的疫苗蛋白將被 B 細胞感知，從而產生針對該特定抗原的抗體介導反應。

mRNA疫苗在獸醫領域的應用

口蹄疫（FMD）

迄今為止，已經研究了幾種獸用 mRNA 疫苗。2009 年，報道了針對豬口蹄疫病毒 (FMDV) 的 RNA 免疫。單次免疫 500 μg 全長嵌合 O1K/C-S8 RNA 可誘導細胞介導和抗體介導的免疫反應。Pulido等人給小鼠接種了低劑量和高劑量的 FMDV轉錄本，這些轉錄本編碼的病毒突變體分別刪除了病毒 RNA的兩個莖環結構。接種后 15 天，幾乎 60 % 的動物表現出對 FMDV 的顯著中和抗體反應。本研究中較高的 RNA 劑量并不一定會導致更高的中和抗體濃度。此外，低劑量組小鼠中70%的中和抗體濃度較高。相比之下，高劑量組小鼠中只有不到50%的中和抗體濃度可檢測到。經口蹄疫病毒（FMDV）攻擊后，抗體檢測呈陽性、病毒檢測呈陰性的小鼠被認為受到保護（38%）。受保護小鼠的FMDV抗體濃度比mRNA免疫后第15天測得的抗體濃度高出3倍。

波瓦桑病毒（POWV）

2018 年，一種以脂質納米顆粒遞送的 mRNA疫苗被證明具有保護作用，該疫苗編碼了波瓦桑病毒(POWV)的 prM 和 E 基因，波瓦桑病毒是一種感染鹿的新型蜱傳黃病毒。小鼠肌肉注射10 μg mRNA。免疫 28 天后使用相同劑量作為加強針。加強針四周后，用兩種 POWV 毒株對小鼠進行攻擊。所有接種疫苗的小鼠均存活，而安慰劑組100% 的小鼠在這次致命攻擊后死亡。此外，在感染前一天將接種疫苗的小鼠的血清被動轉移至未接種疫苗的小鼠可保護 100% 的接種者。此外，據報道，本研究中疫苗誘導的免疫反應可產生針對Langat 病毒和其他蜱傳黃病毒的交叉反應抗體介導的應答。

偽狂犬病毒（PRV）

一種針對偽狂犬病毒(PRV)的 mRNA 疫苗最近已在小鼠中進行了測試。該疫苗基于糖蛋白D (gD) 設計，并在免疫后監測了八周的抗體反應。在第四周檢測到最高的特異性 IgG 和中和抗體濃度，并且在間隔 14 天的加強針后，PRV 特異性中和抗體的濃度得到增強。接種組還顯示血液來源的單核細胞中干擾素 (IFN)-γ和白細胞介素 (IL)-2 等細胞因子顯著上調。與對照組相比，接種組血液中的 CD4 + /CD8 + T 細胞比率更高。然后用 PRV 攻擊免疫的小鼠 (n=15)，并評估動物的臨床癥狀、體重減輕和 15 天的存活率。絕大多數（95%）接種疫苗的小鼠保持健康，而所有對照組小鼠均死亡。

豬流行性腹瀉（PED）

一種針對由冠狀病毒科成員豬流行性腹瀉病毒引起的豬流行性腹瀉 (PED) 的 mRNA 疫苗已被證明是有效的。豬地方性腹瀉病毒是一種腸道致病病毒，其囊膜上包含一個刺突 (S)糖蛋白。S蛋白在與宿主細胞受體結合方面起著關鍵作用，并含有許多誘導中和抗體產生的受體。針對 PED 的RNA 疫苗是第一個獲得許可用于控制 PED 病毒的源自alphavirus的復制子RNA 顆粒疫苗。該疫苗采用復制子載體系統，利用委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)，在豬細胞內有效運輸和擴增 PED 病毒 S 糖蛋白抗原。該mRNA疫苗在母豬體內誘導產生中和抗體，并在哺乳仔豬體內被動獲得抗體。研究結果進一步表明，受攻毒仔豬病毒脫落減少，受攻毒母豬分娩死亡率降低。

禽流感病毒

一項關于雞禽流感疫苗的研究使用了蛋白包被的殼聚糖納米顆粒（CNP）包裝的mRNA疫苗。測試了三組疫苗：a) 含有HA2-HA1和M2e抗原mRNA且表面帶有蛋白質的CNP（CNP+RNA+Pr）；b) 表面帶有蛋白質的空CNP（CNP+Pr）；以及c) 空CNP。第二劑疫苗接種后，接種疫苗的雞接受H7N9或H9N2病毒攻擊。與其他組相比，CNP+RNA+Pr疫苗的效果最為理想，病毒載量更低，病毒源性病變減少，免疫應答更強。具體而言，在CNP+RNA+Pr組中觀察到HA2特異性IgY和IgA水平更高，病毒中和滴度（VNT）也增強。此外，該研究還強調了針對 HA2-HA1 抗原的顯著 CD4+ T 細胞反應。

狂犬病

在最近的一項研究中，Stokes 等人采用了一種自擴增 mRNA 疫苗技術，用于對抗大鼠狂犬病毒。該疫苗以編碼狂犬病糖蛋白 G 的甲病毒基因組為靶抗原構建。該疫苗以大鼠肌肉注射的方式進行，共注射四次，每次間隔兩周。結果顯示，在注射部位和引流淋巴結中存在狂犬病糖蛋白 RNA（用于疫苗設計），其水平隨時間推移而降低，但最遲在第60 天仍可檢測到。狂犬病糖蛋白 RNA 也在血液、肺、脾和肝臟中短暫存在。該疫苗被證明可有效誘導抗體介導的免疫反應。接種疫苗后第46天，接受治療的小鼠的狂犬病毒特異性抗體水平（IgG）顯著升高，即使在第71天的恢復期后也持續存在。抗體在恢復期后仍持續存在，表明該疫苗具有誘導持續長期免疫反應的潛力。總體而言，結果表明狂犬病mRNA疫苗在大鼠體內耐受性良好，支持其臨床開發的潛力。

牛呼吸道合胞病毒

美國農業部正在進行一項研究，旨在開發一種針對牛呼吸道合胞病毒 (RSV) 的新型 mRNA 疫苗系統。RSV是一種重要的病毒病原體，會影響犢牛，并導致呼吸道疾病綜合征。RSV免疫力持續時間短，傳統的蛋白質疫苗在現實農場環境中，由于存在各種應激源和共傳播病原體，效果可能不佳。為了解決這些問題，一項研究旨在尋找一種經濟高效的 mRNA 疫苗系統，該系統可能產生更熱穩定的轉錄本，適合農場免疫接種。

非洲豬瘟（ASF）和古典豬瘟（CSF）

美國農業部正在進行的另一個項目包括開發自擴增mRNA納米顆粒技術，用于治療豬非洲豬瘟（ASF）和經典豬瘟（CSF）。mRNA插入片段源自TC-83甲病毒的非結構基因。該疫苗平臺將包含表達20種病毒蛋白的轉基因序列，包括非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬瘟病毒（CSFV）或兩種病毒蛋白的組合。

豬流感病毒

針對豬流感的mRNA 疫苗的構建和使用已經有了顯著的改進。默沙東動保提供了第三代RNA 顆粒技術“SEQUIVITY”，該技術能夠根據需要針對不斷進化的病毒和細菌病原體生產針對特定畜群和菌株的 RNA 疫苗。該平臺使用源自 VEEV TC-83 疫苗株的α病毒復制子載體系統生產了 SEQUIVITY?豬流感病毒疫苗(SWV)。該疫苗此前已被證明可在小鼠和豬中誘導強烈的抗體和細胞介導的免疫反應。此外，該平臺提供了定制疫苗的靈活性，可實現針對特定畜群的配方。H3N2 RNA 疫苗的免疫原性和有效性試驗表明，在加強接種后三周內可產生保護性血凝抑制反應，隨后產生抗原特異性 IFN-γ反應，從而最大限度地減少鼻腔脫落，并減輕豬的臨床 SIV 疾病。

加拿大食品檢驗局 (CFIA) 的加拿大獸用生物制品中心(CCVB)最近批準在加拿大全國范圍內使用針對豬流感病毒(SIV) 的 RNA 疫苗。SIV 疫苗的預期用途涉及在獸醫處方和監督下的特定農場，其中將選擇來自受感染場所的SIV 血凝素(HA) 基因序列來開發農場/菌株特異性 SIV 疫苗，該疫苗封裝在源自 VEEV TC-83 疫苗株的病毒樣 RNA 復制子顆粒 (VRP) 中。值得注意的是，VRP 缺乏產生其結構蛋白的遺傳成分，導致其繁殖缺陷。這種漸進式方法與默沙東動保商業豬流感疫苗（USDA 產品代碼 19A5.D0，CCVB 文件 880VV/S3.0/H16）一致。默沙東的商業 SIV 疫苗含有來自美國中西部的Clade IV H3N2 SIV 臨床分離株的 HA 基因。基于 VEEV 的 VRP 之前已在豚鼠、大鼠、兔子、牛、恒河猴、食蟹猴和人類身上進行過測試，沒有不良反應。在六周齡豬中，商業 SIV 疫苗已成功以 50 倍更高的劑量進行測試。主要劑量通過肌肉注射，而另一劑量同時通過靜脈注射。結果表明，在接種疫苗和接觸疫苗的豬中，接種疫苗后第 3、7、10、14 天的直腸和鼻拭子樣本中沒有復制的 VRP。同樣，接種疫苗的豬表現出血清轉化滴度，而接觸豬均未表現出抗HA抗體，這進一步支持了疫苗無法從接種疫苗的豬傳播給接觸豬的觀點。接種疫苗后未報告任何不良事件。

馬立克氏病病毒（MDV）

馬立克氏病病毒 (MDV) 是一種致癌性、雞高度傳染性的甲型皰疹病毒。研究團隊最近開發了一種二價 mRNA 疫苗，該疫苗編碼了 MDV 的糖蛋白 B 和磷蛋白 38 抗原，并負載于脂質納米顆粒中。為了評估該疫苗的有效性，研究測量了MDV 基因組載量、病變評分（發生腫瘤病變的器官數量）、腫瘤發生率和細胞因子表達。

與對照組相比，兩次接種 10 μg mRNA（間隔十四天）的疫苗顯著降低了腫瘤發生率、平均病變評分、法氏囊萎縮和羽毛尖端的 MDV 負荷（圖 2）。

圖 2 . mRNA 疫苗從設計到免疫反應的示意圖。（1）將靶抗原最新序列的 RNA 構建體用遞送裝置（例如脂質或殼聚糖納米顆粒）封裝。在接種疫苗之前，對含有 mRNA 的納米顆粒進行大小、電荷、細胞攝取和蛋白質表達評估。（2）mRNA 疫苗已在人類、小鼠、雞、豬和牛等不同物種中進行了測試。人和動物的 mRNA 疫苗接種均能誘導針對各種病毒的有效免疫反應。（3）已證明 mRNA 疫苗接種可誘導抗體和細胞介導的免疫反應。細胞攝取后，模式識別受體會感知 mRNA ，從而釋放I 型干擾素和促炎細胞因子。利用細胞機制，mRNA代碼將被翻譯成靶抗原。疫苗蛋白將被釋放到細胞外空間或呈遞到 MHC-I 或/和 II 分子上。完整的蛋白質將被 B 細胞感知，從而產生抗體介導的反應，而 MHC 分子上的肽呈遞會激活 CD4 和 CD8 T 細胞。

mRNA疫苗的潛在問題

盡管RNA疫苗在快速靈活的設計和開發方面優于現有疫苗，但仍需注意一些挑戰。RNA不穩定性、過度的炎癥反應、劑量以及體內遞送效率低下等問題需要進一步考慮和改進。

未受保護的 RNA 極易被細胞外RNase降解。為了解決這個問題并確保有效的 RNA內化，人們設計了各種試劑來促進 mRNA遞送至細胞質。添加 5' 帽并在 5′和 3′非翻譯區兩側添加可穩定 mRNA序列并延長其半衰期。建議添加理想長度的poly(A) 尾以增強 mRNA 構建體的穩定性和翻譯能力。高鳥嘌呤和胞嘧啶含量是另一種與體外恒定 mRNA 濃度和體內蛋白質表達相關的修飾。

疫苗接種后，外源性mRNA被各種先天免疫受體識別后，表現為病原體相關分子模式（PAMP）。外源性RNA的這種免疫刺激特性可以被認為是一把雙刃劍。佐劑通常與疫苗聯合使用，以啟動和增強促炎狀態，促進樹突狀細胞（DC）成熟，從而激活更強烈的適應性免疫反應。mRNA的這種佐劑樣特性促進了這種途徑。然而，先天免疫系統對mRNA的識別可能導致抗原呈遞缺陷和不適當的免疫反應。為了解決這些問題，修飾核苷如假尿苷和1-甲基假尿苷已經被開發并用于基于修飾mRNA的治療領域。

與基于 mRNA 的疫苗和其他基于 RNA 的療法相關的另一個擔憂是體內遞送不足。在這方面，已經提出了體外裝載 DC、機械（槍）和結內注射等方法。由于這些方法的復雜性和相關成本，它們并不廣泛適用。因此，仍然需要一種既能誘導有效的免疫反應，又能保證裸露的 mRNA 安全且不被降解的方法。與體內遞送相關的問題之一是劑量。疫苗劑量不理想會導致免疫反應不足。另一方面，過量給藥可能會因納米顆粒在肝臟蓄積而導致毒性，此外還會導致過度的免疫反應和/或誘導免疫系統的效應細胞產生耐受性。

外源mRNA的耐受性、穩定性、生物分布和消除在動物體內可能存在差異。例如，Tahtinen等人最近的一項研究表明，小鼠和人類對等劑量mRNA疫苗的反應不同，小鼠可以耐受高出1000倍的mRNA相對劑量（按體重計算）。

據我們所知，尚未在接種mRNA疫苗的動物的牛奶、肉類或蛋類中檢測或報告mRNA疫苗的存在。另一方面，大多數動物源性食品產品，例如牛奶、肉類和蛋類，都會經過滅菌或烹飪處理，這會導致任何mRNA殘留物完全降解。此外，接種mRNA疫苗的食用動物將被要求停藥，這消除了動物產品中存在殘留的可能性。總體而言，獸用mRNA疫苗被認為是安全的，因為它在動物體內具有更高的耐受性，并且在食品加工過程中任何mRNA殘留物都會完全降解。

mRNA疫苗在獸醫領域的未來前景

mRNA 疫苗在人體臨床應用中的成功為獸醫領域的 mRNA疫苗平臺打開了大門。病毒感染仍然是畜牧業和家禽業的持續威脅。提高 mRNA 疫苗效力的一個潛在策略是使用嵌合體序列來誘導免疫反應。嵌合體疫苗包含來自各種病毒變體（例如 HIV）的成分，將它們混合在一起以誘導更廣泛的免疫反應。例如，使用含有 GP5 嵌合體序列的DNA 疫苗來對抗新出現的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) 變體，已證明其對豬體內流行的PRRSV 毒株的病毒攻擊具有免疫保護作用。強調在 mRNA疫苗框架內從新出現的毒株中創建合成嵌合體抗原的想法可能會提供更廣泛的免疫反應。

此外，非侵入性遞送途徑，例如鼻內和氣霧劑給藥，越來越受到動物疫苗的青睞，以盡量減少與疫苗接種程序相關的壓力、疼痛和成本。Su等人和Jansen 等人的研究強調了在小鼠中使用非侵入性 mRNA 疫苗遞送方法，包括鼻內和肺部給藥（液體和粉末形式）作為mRNA 疫苗的替代遞送途徑。2022 年，Abramson等人測試了一種在豬中口服核酸治療劑的新方法，即自定位毫米級涂藥器 (SOMA) 藥丸。每粒藥丸含有 50 μg（80 mL）編碼Cre 重組酶的 mRNA ，并用納米顆粒包裹。研究人員合成并篩選了一系列支鏈雜化聚（β-氨基酯）mRNA納米顆粒，并將其與可吞咽的毫微注射膠囊結合，直接遞送至胃組織。這項研究證明了mRNA在小鼠和豬的胃黏膜細胞中的蛋白質翻譯以及全身攝取。利用自定位SOMA藥丸，他們實現了藥物精準遞送至胃組織的血管化層，從而繞過了胃腸道中的降解酶。

在獸醫領域通過mRNA疫苗接種進行有效的疾病控制可以通過兩種主要方式直接影響人類和公共健康：a）控制動物種群中新出現和重新出現的人畜共患病原體，以防止傳播給人類，b）通過對食用動物進行有效的疫苗接種，維持人類糧食的可持續性，并防止在動物中爆發病毒/細菌疫情后出現糧食不安全的情況。

結論

關于RNA疫苗有效性的報告正在迅速積累，所有報告一致認為，這項新技術有可能產生針對不同病毒和細菌病原體的有效免疫反應。快速的研發速度、低成本和安全性是這類疫苗的一些關鍵優勢。mRNA疫苗可作為獸醫領域一個安全且前景廣闊的平臺。通過mRNA疫苗誘導針對多種家禽、牛和豬病毒的免疫力，可以預防新發病原體的流行病、動物流行病和大流行，并有助于實現可持續的糧食體系。

原文：F. Fazel, J. S. Doost, S. Raj, et al., The mRNA vaccine platform for veterinary species. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2024.

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