四川大學(xué)張興棟院士團(tuán)隊(duì)ACS Nano：開發(fā)出新型仿生涂層，為心臟封堵器植入帶來組織愈合新希望

先天性心臟病是最常見的新生兒出生缺陷，全球發(fā)病率約為0.6-1.2%，其中約60%的病例需要干預(yù)治療。目前，微創(chuàng)經(jīng)導(dǎo)管封堵器植入術(shù)已成為治療房間隔缺損、室間隔缺損等先天性心臟缺陷的主要手段。然而，臨床實(shí)踐中封堵器植入仍面臨著重大的挑戰(zhàn)：材料相對不足的生物相容性往往導(dǎo)致凝血、持續(xù)性炎癥、內(nèi)皮化不完全以及組織愈合延遲，這些情況常引發(fā)長期臨床并發(fā)癥，如器械相關(guān)血栓、封堵器移位或脫落、局部殘余血液分流以及廣泛纖維組織增生。因此，如何優(yōu)化封堵器性能，實(shí)現(xiàn)快速再內(nèi)皮化和原位組織愈合，成為當(dāng)前研究的迫切需求。

針對這一臨床難題，四川大學(xué)張興棟院士、楊立副研究員團(tuán)隊(duì)提出了一種基于細(xì)胞外基質(zhì)仿生理念的微環(huán)境調(diào)控涂層。該研究通過使用具有抗污作用的聚乙二醇連接鏈，利用高效的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將具有高細(xì)胞粘附活性的定制重組人源化I型膠原蛋白接枝到材料表面。體外血液和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該涂層不僅改善了血液相容性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長，還能增強(qiáng)心肌細(xì)胞功能。皮下和血管內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該涂層通過誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向抗炎表型極化來減輕炎癥反應(yīng)，加速內(nèi)皮化進(jìn)程，并促進(jìn)組織修復(fù)。這一研究成果為優(yōu)化心臟封堵器性能、提升臨床療效提供了極具前景的新策略。相關(guān)論文以“Tailored Extracellular Matrix-Biomimetic Coating Favors Tissue Healing by Modulating the Microenvironment”為題，發(fā)表在

ACS Nano

研究團(tuán)隊(duì)首先對定制的重組人源化I型膠原蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)表征和生物相容性評估。結(jié)果顯示，rhCol I形成了穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，具有與天然I型膠原相似的高級結(jié)構(gòu)。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)表明，與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后，rhCol I在促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖方面顯著優(yōu)于多種動(dòng)物來源的膠原蛋白。免疫原性結(jié)果也證實(shí)，rhCol I引發(fā)的免疫反應(yīng)最輕微，與陰性對照組無顯著差異，展現(xiàn)了其在植入器械表面改性中的巨大應(yīng)用潛力和優(yōu)勢。

圖1. 定制的ECM仿生微環(huán)境調(diào)控涂層的（A）制備過程和（B）功能模型示意圖。 首先，裸材料經(jīng)過等離子體處理后在其表面獲得活性羥基。隨后，通過炔基-PEG-硅烷末端的三乙氧基硅烷基團(tuán)與羥基的縮合反應(yīng)，將炔基-PEG-硅烷鏈固定在基底表面，制備APS涂層。最后，通過其氨基與炔基-PEG-硅烷鏈另一端的炔基之間的共價(jià)點(diǎn)擊反應(yīng)，將定制的rhCol I引入系統(tǒng)，制備APS/rhCol I涂層。涂層中的PEG長鏈能快速吸水形成穩(wěn)定的水化層，發(fā)揮抗污功能，防止血液成分粘附，從而實(shí)現(xiàn)抗凝和抗炎效果。rhCol I豐富的GER和GEK基序可與細(xì)胞膜表面的整合素結(jié)合，模擬ECM并促進(jìn)細(xì)胞粘附，從而加速內(nèi)皮化。

基于這一優(yōu)異的生物材料，研究人員通過兩步法制備了APS/rhCol I涂層。掃描電鏡和原子力顯微鏡圖像顯示，在經(jīng)過等離子處理的基礎(chǔ)材料表面，APS涂層形成了均勻連續(xù)的薄膜，粗糙度為17.00±1.29納米，厚度為21.40±0.80納米。當(dāng)進(jìn)一步引入rhCol I后，APS/rhCol I涂層表面變得更加致密，粗糙度和厚度分別增加至21.13±1.30納米和25.67±1.01納米。衰減全反射傅里葉變換紅外光譜和X射線光電子能譜分析證實(shí)了涂層的成功構(gòu)建：APS/rhCol I涂層在1645 cm?1和1544 cm?1處出現(xiàn)了歸屬于rhCol I肽鍵中C=O伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)的新峰，且氮元素比例顯著增加。水接觸角測試表明，APS涂層因PEG分子富含醚鍵和羥基，顯著提升了基底親水性。動(dòng)態(tài)水接觸角結(jié)果直接證實(shí)了涂層中PEG鏈的快速水合作用，能夠在固-液界面形成膨脹的動(dòng)態(tài)富水水合層。石英晶體微天平耗散監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中，APS涂層上顯著的頻率下降和耗散上升，是PEG鏈吸附并鍵合大量水分子形成柔軟粘彈性水合層的直接證據(jù)。APS/rhCol I涂層則表現(xiàn)出更明顯的頻率下降和耗散上升，這歸因于rhCol I本身作為柔軟的、可結(jié)合大量水的多孔蛋白網(wǎng)絡(luò)，與PEG水合作用協(xié)同，形成了更厚、更具粘彈性的復(fù)合水合層。在長達(dá)60天的模擬生理流體動(dòng)態(tài)沖刷實(shí)驗(yàn)中，APS/rhCol I涂層展現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)完整性和功能組分穩(wěn)定性。熒光圖像顯示，即使經(jīng)過60天沖洗，涂層表面仍能保留初始熒光強(qiáng)度的40.03±4.25%，BCA定量檢測也證實(shí)rhCol I的保留率仍達(dá)42.75%，為其長期穩(wěn)定性提供了初步證據(jù)。

圖2. 涂層的表征。 （A）裸PDO、APS和APS/rhCol I涂層的SEM和（B）AFM圖像。不同樣品的（C）表面粗糙度和（D）涂層厚度。不同樣品的（E）ATR-FTIR光譜、（F）XPS寬掃光譜和（G-I）XPS C 1s高分辨窄譜。（J）不同時(shí)間點(diǎn)樣品的水接觸角。通過QCM-D監(jiān)測的裸、APS和APS/rhCol I涂層鍍金石英晶體的實(shí)時(shí)（K）頻率和（L）耗散變化。（M）基于蠕動(dòng)泵的循環(huán)系統(tǒng)示意圖。（N）FITC標(biāo)記的APS/rhCol I涂層在PBS沖洗0、7、15、30和60天后的熒光圖像。（O）APS/rhCol I涂層在PBS沖洗0、7、15、30和60天后的熒光強(qiáng)度和rhCol I密度的定量統(tǒng)計(jì)。

在血液相容性評價(jià)中，靜態(tài)血小板粘附結(jié)果顯示，APS和APS/rhCol I涂層表面僅粘附少量未活化球形血小板，而未經(jīng)修飾的PDO表面則粘附大量伸出偽足、呈鋪展形態(tài)的活化血小板。血小板形態(tài)統(tǒng)計(jì)和乳酸脫氫酶定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了涂層優(yōu)異的抗血細(xì)胞粘附能力。P-選擇素免疫熒光染色顯示，APS/rhCol I組血小板表面P-選擇素表達(dá)水平顯著低于PDO組，表明涂層有效抑制了血小板活化。即使經(jīng)過30天沖洗，APS/rhCol I涂層仍保持著顯著的抗血小板粘附和活化能力。新西蘭大白兔的體外血液循環(huán)實(shí)驗(yàn)直觀顯示，經(jīng)過2小時(shí)循環(huán)后，未經(jīng)修飾的PDO表面沉積了大量血栓，管腔閉塞率達(dá)44.41±5.35%，血栓重量達(dá)21.89±3.59毫克；而APS和APS/rhCol I涂層組幾乎未見管腔閉塞和可見血栓。掃描電鏡圖像進(jìn)一步證實(shí)，未修飾的PDO表面被纖維蛋白、血小板和紅細(xì)胞聚集形成的血栓覆蓋，而涂層表面僅粘附少量稀疏血小板。所有樣品的溶血率均低于1%，遠(yuǎn)低于5%的安全標(biāo)準(zhǔn)，表明涂層無溶血風(fēng)險(xiǎn)。

圖3. 涂層的血液相容性評價(jià)。 （A）血小板在裸、APS和APS/rhCol I涂層PDO基底上粘附的SEM圖像和（B）計(jì)數(shù)。（C）基于活化程度的血小板形態(tài)分類和統(tǒng)計(jì)。（D）LDH定量分析和（E）不同樣品表面的全血粘附SEM圖像。（F）粘附于不同樣品表面的血小板P-選擇素表達(dá)的定量統(tǒng)計(jì)和（G）免疫熒光圖像。（H）兔離體血液循環(huán)動(dòng)靜脈分流模型示意圖。（I）循環(huán)2小時(shí)后不同組導(dǎo)管橫截面和樣品表面的照片。不同組（J）管腔閉塞率和（K）血栓重量的統(tǒng)計(jì)。（L）離體循環(huán)2小時(shí)后不同樣品表面的SEM圖像。（M）不同樣品的溶血率統(tǒng)計(jì)。

為評估涂層促進(jìn)體內(nèi)再內(nèi)皮化的潛力，研究人員系統(tǒng)研究了APS/rhCol I涂層對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長行為的影響。活/死細(xì)胞染色和CCK-8分析顯示，所有樣品表面細(xì)胞均存活良好，無細(xì)胞毒性。與PDO組相比，APS表面因PEG抗污作用，內(nèi)皮細(xì)胞粘附和增殖有所下降；而APS/rhCol I表面引入富含高細(xì)胞粘附片段（GER和GEK）的rhCol I后，內(nèi)皮細(xì)胞生長活性顯著增強(qiáng)。細(xì)胞骨架染色和劃痕實(shí)驗(yàn)表明，APS/rhCol I表面的內(nèi)皮細(xì)胞鋪展形態(tài)更佳，遷移活性也得到顯著促進(jìn)。體外管形成實(shí)驗(yàn)顯示，APS/rhCol I組形成了更多的管狀結(jié)構(gòu)， junctions數(shù)量和總管長均顯著增加，表明該涂層具有促進(jìn)血管生成的潛力。RNA測序分析顯示，與PDO組相比，APS/rhCol I組有212個(gè)基因上調(diào)，358個(gè)基因下調(diào)。KEGG通路富集分析表明，上調(diào)通路主要與細(xì)胞粘附和增殖相關(guān)，而下調(diào)通路多與炎癥相關(guān)。基因集富集分析和Western blot結(jié)果證實(shí)，APS/rhCol I涂層通過與細(xì)胞膜整合素結(jié)合，激活PI3K-Akt信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞生長，為其促內(nèi)皮化功能提供了直接的分子機(jī)制證據(jù)。

圖4. HUVEC生長行為評價(jià)。 （A）在裸、APS和APS/rhCol I涂層PDO基底上培養(yǎng)1天和3天后HUVEC的活死染色圖像和（B）細(xì)胞活力。（C）FDA染色圖像和（D）在不同樣品表面遷移1天和2天的HUVEC遷移率統(tǒng)計(jì)。（E）FDA染色圖像、（F）連接點(diǎn)數(shù)量和（G）用PDO、APS和APS/rhCol I提取物處理8小時(shí)后Matrigel上HUVEC管形成的總管長度。HUVEC的RNA測序分析。（H）在裸PDO和APS/rhCol I涂層上培養(yǎng)的HUVEC中，差異表達(dá)基因的火山圖。PDO組與APS/rhCol I組中（I）上調(diào)基因和（J）下調(diào)基因的KEGG通路富集分析氣泡圖。PDO組與APS/rhCol I組中（K）上調(diào)基因和（L）下調(diào)基因的KEGG通路富集分析弦圖。與PDO組相比，在APS/rhCol I涂層組中獲得的與（M）細(xì)胞粘附和增殖、（N）細(xì)胞遷移、（O）血管生成和（P）炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)的差異表達(dá)基因熱圖。GO通路富集分析。PDO組與APS/rhCol I組中（Q）運(yùn)動(dòng)蛋白、（R）細(xì)胞粘附和（S）細(xì)胞遷移的GSEA圖。（T）基于STRING數(shù)據(jù)庫的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。（U）在裸PDO和APS/rhCol I涂層上培養(yǎng)3天的HUVEC中PI3K、Akt和p-Akt表達(dá)的Western blot分析，以及（V）相應(yīng)的定量統(tǒng)計(jì)。（W）APS/rhCol I涂層促進(jìn)細(xì)胞生長的示意圖。

考慮到器械植入心臟環(huán)境后對心肌細(xì)胞安全性和功能性的影響，研究團(tuán)隊(duì)評估了APS/rhCol I涂層對大鼠心肌細(xì)胞H9c2的細(xì)胞相容性。細(xì)胞骨架染色和CCK-8結(jié)果顯示，APS涂層因PEG的抗污作用降低了H9c2細(xì)胞的粘附和增殖；而引入rhCol I后，這些細(xì)胞行為得到顯著改善。更重要的是，APS/rhCol I表面的H9c2細(xì)胞呈現(xiàn)更長的長徑比、更大的細(xì)胞面積和更有序的纖維排列，這對心肌細(xì)胞的收縮功能至關(guān)重要。RNA測序分析顯示，APS/rhCol I涂層組有284個(gè)基因上調(diào)和109個(gè)基因下調(diào)。KEGG和GO通路富集分析表明，差異表達(dá)基因顯著富集于與心臟興奮-收縮耦聯(lián)和收縮力調(diào)節(jié)直接相關(guān)的通路，如鈣信號通路、多巴胺能突觸等。Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，與PDO組相比，APS/rhCol I組H9c2細(xì)胞中連接蛋白43、心肌肌鈣蛋白T和α-輔肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平顯著升高，從蛋白質(zhì)水平證實(shí)了涂層增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮功能的積極作用。

圖5. H9c2細(xì)胞生長行為評價(jià)。 （A）在裸、APS和APS/rhCol I涂層PDO基底上培養(yǎng)1天和3天后H9c2細(xì)胞的細(xì)胞骨架染色圖像，以及（B）細(xì)胞活力、（C）細(xì)胞長徑比和（D）細(xì)胞面積的定量統(tǒng)計(jì)。H9c2細(xì)胞的RNA測序分析。（E）主成分分析圖。（F）在裸PDO和APS/rhCol I涂層上培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中，差異表達(dá)基因的火山圖。（G）PDO組與APS/rhCol I組的KEGG通路富集分析氣泡圖。（H）PDO組與APS/rhCol I組的GO通路富集分析條形圖。（I）PDO組與APS/rhCol I組中與心肌收縮相關(guān)的KEGG通路富集分析弦圖。（J）在KEGG通路富集分析中，與PDO組相比，APS/rhCol I涂層組中與心肌收縮相關(guān)的差異表達(dá)基因熱圖。（K）在裸PDO和APS/rhCol I涂層上培養(yǎng)3天的H9c2細(xì)胞中Cx43、cTnT和α-actinin表達(dá)的Western blot分析，以及（L）相應(yīng)的定量統(tǒng)計(jì)。

為評估涂層的炎癥反應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)研究了小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的生長行為。細(xì)胞骨架染色和CCK-8結(jié)果顯示，PDO表面粘附大量呈伸長拉伸形態(tài)的活化巨噬細(xì)胞；APS表面因PEG分子抗污作用，巨噬細(xì)胞粘附顯著減少；APS/rhCol I表面巨噬細(xì)胞粘附雖略高于APS組，但仍遠(yuǎn)低于PDO組，且細(xì)胞呈靜息球形。ELISA檢測顯示，APS/rhCol I組細(xì)胞表達(dá)更多的抗炎細(xì)胞因子TGF-β1，更少的促炎細(xì)胞因子TNF-α。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，與PDO組相比，APS/rhCol I涂層顯著降低了M1型標(biāo)志物CD86+細(xì)胞比例，同時(shí)顯著提高了M2型標(biāo)志物CD206+細(xì)胞比例。RNA測序分析顯示，APS/rhCol I組有148個(gè)基因下調(diào)，276個(gè)基因上調(diào)。KEGG通路富集分析表明，差異表達(dá)基因顯著富集于IL-17信號通路、JAK-STAT信號通路等多個(gè)炎癥相關(guān)通路。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，M1型相關(guān)基因mRNA表達(dá)下降，M2型相關(guān)基因表達(dá)顯著上升。這些結(jié)果證實(shí)，APS/rhCol I涂層能有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向抗炎的M2表型極化，抑制炎癥反應(yīng)。

圖6. 炎癥反應(yīng)評價(jià)。 （A）在裸、APS和APS/rhCol I涂層PDO基底上培養(yǎng)2天后RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞骨架染色圖像和（B）細(xì)胞活力。通過ELISA試劑盒測定RAW264.7細(xì)胞中（C）TNF-α和（D）TGF-β1的表達(dá)。（E）在裸、APS和APS/rhCol I涂層PDO基底上培養(yǎng)2天后，RAW264.7細(xì)胞中CD206和CD86的流式細(xì)胞術(shù)分析圖像和（F）定量統(tǒng)計(jì)。RAW264.7細(xì)胞的RNA測序分析。（G）在裸PDO和APS/rhCol I涂層上培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞中，差異表達(dá)基因的火山圖。（H）PDO組與APS/rhCol I組的KEGG通路富集分析桑基氣泡圖。（I）PDO組與APS/rhCol I組的GO通路富集分析條形圖。（J）桑基氣泡圖中差異表達(dá)基因的熱圖。（K）通過qRT-PCR定量分析PDO組與APS/rhCol I組中代表性基因的表達(dá)。

在大鼠皮下植入模型中，組織學(xué)評估顯示，植入15天和30天后，PDO、APS和APS/rhCol I樣品周圍纖維囊厚度依次減小。免疫熒光分析表明，在整個(gè)植入期間，APS/rhCol I組比PDO組表達(dá)更多的抗炎因子IL-10，更少的促炎因子TNF-α，與體外巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。血管生成評估顯示，植入15天時(shí)，APS/rhCol I組CD31和α-SMA的表達(dá)水平已顯著高于PDO和APS組；30天時(shí)，這種差異進(jìn)一步擴(kuò)大，且APS/rhCol I組新生血管密度較15天顯著增加，表明該涂層能持續(xù)、積極地促進(jìn)血管生成。

圖7. 皮下植入模型中的組織相容性和血管生成評價(jià)。 （A）大鼠皮下植入模型示意圖。植入15天和30天后，包裹裸、APS和APS/rhCol I涂層PDO單絲的纖維囊的（B）蘇木精和伊紅染色圖像和（C）厚度統(tǒng)計(jì)。這些纖維囊中（D）IL-10和TNF-α表達(dá)的免疫熒光染色圖像和（E、F）定量統(tǒng)計(jì)。（G）這些纖維囊中CD31和α-SMA表達(dá)的免疫熒光染色圖像和（H、I）定量統(tǒng)計(jì)。

在兔頸動(dòng)脈血管內(nèi)植入模型中，研究人員通過免疫熒光染色評估了涂層表面CD31和eNOS的表達(dá)。植入20天后，PDO表面僅見稀疏分布的CD31和eNOS信號，而APS/rhCol I表面信號顯著增加；40天時(shí)，PDO組信號有所上升，但APS/rhCol I組信號已高達(dá)94.90±6.29%和93.24±5.69%；80天時(shí)，PDO組仍存在不連續(xù)、異質(zhì)性的熒光信號，而APS/rhCol I組實(shí)現(xiàn)了100%的完全內(nèi)皮覆蓋，CD31和eNOS信號連續(xù)、致密、均勻分布，形態(tài)上類似于鄰近的天然血管內(nèi)皮。H&E染色和CD68免疫組化分析顯示，植入20天和40天時(shí)，APS/rhCol I組新生內(nèi)膜面積顯著小于PDO組，CD68密度也遠(yuǎn)低于PDO組。80天時(shí)，PDO組持續(xù)呈現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)，新生內(nèi)膜增生隨時(shí)間推移顯著進(jìn)展；而APS/rhCol I組始終保持低水平的CD68信號，有效抑制了病理性新生內(nèi)膜增生，展現(xiàn)出優(yōu)異的長期組織相容性。

圖8. 血管內(nèi)植入模型中的再內(nèi)皮化和組織愈合評價(jià)。 （A）兔頸動(dòng)脈中PDO單絲植入模型示意圖。植入20、40和80天后，裸和APS/rhCol I涂層PDO單絲表面上（B）CD31和eNOS表達(dá)的免疫熒光染色圖像和（C、D）定量統(tǒng)計(jì)。植入20、40和80天后，含有單絲的血管橫截面的（E）H&E染色圖像和（F）新生內(nèi)膜面積定量統(tǒng)計(jì)。這些橫截面中（G）CD68表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像和（H）定量統(tǒng)計(jì)。（I）這些血管橫截面中CD31表達(dá)的免疫熒光染色圖像。（J）內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率的定量統(tǒng)計(jì)。

綜上所述，這項(xiàng)研究通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將功能化的炔基-PEG-硅烷鏈與定制的重組人源化I型膠原蛋白結(jié)合，成功開發(fā)出一種用于心臟封堵器的細(xì)胞外基質(zhì)仿生微環(huán)境調(diào)控涂層。該涂層中的炔基-PEG-硅烷鏈通過形成水合層發(fā)揮抗污作用，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗血栓形成和抗炎細(xì)胞浸潤能力；富含高細(xì)胞粘附片段的rhCol I則通過與細(xì)胞膜整合素結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，并通過調(diào)控多種信號通路改善心肌細(xì)胞功能。皮下和血管內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)證實(shí)，APS/rhCol I涂層通過調(diào)控炎性細(xì)胞極化抑制炎癥，促進(jìn)再內(nèi)皮化和組織愈合。這種定制化的細(xì)胞外基質(zhì)仿生涂層為封堵器植入后營造了有利的微環(huán)境，在提高封堵器臨床療效方面展現(xiàn)出巨大潛力。未來，研究團(tuán)隊(duì)將致力于將這項(xiàng)涂層技術(shù)轉(zhuǎn)化到全尺寸封堵器上，在心臟缺損大動(dòng)物模型中評估其長期性能，并探索其在其他類型植入式醫(yī)療器械中的應(yīng)用前景。