北航常凌乾團隊《Small》：高通量芯片解鎖活細胞內蛋白互作的瞬間

導讀

蛋白-蛋白相互作用是調控細胞增殖、遷移、信號轉導等生命過程的核心機制。深入解析蛋白互作與細胞行為之間的動態關系，對于理解腫瘤發生發展、耐藥機制以及開發精準治療策略具有重要意義。然而，傳統檢測方法（如Co-IP、Western blot）依賴細胞裂解，只能提供群體平均化的“靜態快照”，無法反映單個活細胞內的真實動態。雙分子熒光互補技術雖可實現活細胞成像，但其大分子量熒光蛋白標簽（>10 kDa）可能干擾蛋白天然功能，且轉染效率低，難以實現高通量單細胞分析。

針對活細胞中蛋白互作檢測效率低、通量不足等挑戰，北京航空航天大學常凌乾、董再再，香港城市大學焦艷麗，北京航空航天大學張靖（共同通訊作者）合作報道了一種名為“Pixar”的高通量單細胞生物芯片系統。該系統集成了蛇形微通道單細胞捕獲陣列與納米孔聚焦電場遞送模塊，能夠同時對數千個單細胞進行精準定位與高效分子遞送。通過遞送小分子肽標簽（His/Flag，<1 kDa）標記的蛋白表達質粒及特異性DNA探針，Pixar系統實現了活細胞中蛋白互作的高靈敏、可視化檢測，遞送效率與細胞活性均超過90%，成功避免了傳統大分子標簽對蛋白功能的干擾。基于該系統，研究團隊揭示了AKT-mTOR蛋白互作增強對腫瘤細胞遷移和增殖異質性的調控作用，為精準腫瘤治療提供了新的單細胞層面的理論依據（圖1）。成果以“High-Throughput Single-Cell Biochip System for Functional Interrogation of Protein Interactions in Living Cells”為題，發表在《Small》上。論文第一作者為北京航空航天大學生物與醫學工程學院博士研究生劉馮、安徽醫科大學生物與醫學工程學院碩士研究生吳成寶、北京航空航天大學醫學科學與工程學院副教授楊超娟、北京航空航天大學生物與醫學工程學院博士研究生童一航。

圖1. Pixar系統工作原理及單細胞蛋白互作檢測流程

Pixar系統首先通過蛇形微通道中的鉤狀微結構，利用流體偏轉力實現了高通量單細胞捕獲（>1000個細胞/芯片，捕獲效率>90%）。隨后，利用納米孔聚焦電場技術，在30V低電壓下實現細胞膜可逆電穿孔，將His/Flag小肽標簽標記的AKT和mTOR表達質粒以及特異性DNA探針高效遞送至活細胞內（遞送效率>96%，細胞活性>98%）。小分子肽標簽（<1 kDa）相比傳統熒光蛋白標簽（>10 kDa）對蛋白天然構象和功能影響更小，同時探針通過適配體特異性識別肽標簽，結合鏈置換信號放大策略，實現了蛋白互作信號4倍增強，檢測靈敏度達1 nM（圖2）。

圖2. Pixar系統單細胞捕獲與分子遞送性能驗證

基于上述技術優勢，研究團隊利用Pixar系統對AKT-mTOR蛋白互作進行了單細胞水平的動態監測。結果顯示，AKT-mTOR互作增強顯著促進了腫瘤細胞的遷移和增殖能力，且不同細胞間表現出明顯的異質性響應。通過蛋白組學分析，共鑒定出641個差異表達蛋白，GO和KEGG富集分析表明這些蛋白主要參與糖酵解、細胞黏附、代謝調控等通路，揭示了AKT-mTOR互作調控腫瘤細胞行為異質性的分子網絡（圖3）。

圖3. Pixar系統監測AKT-mTOR互作調控腫瘤細胞異質性

為進一步驗證Pixar系統的普適性，研究團隊選擇了另一對經典癌蛋白KRAS-Raf1進行了驗證。結果表明，Pixar系統同樣能夠高效遞送KRAS和Raf1表達質粒，并成功檢測到二者在活細胞中的特異性互作信號。經KRAS抑制劑處理后，熒光信號顯著降低，證實了檢測的特異性。以上結果充分證明Pixar系統具有良好的通用性，適用于多種蛋白互作的研究場景（圖4）。

圖4. Pixar系統在AKT-mTOR蛋白互作檢測中的應用驗證

綜上所述，Pixar系統集高效遞送、多靶標檢測、長時程單細胞表型監測于一體，為藥物篩選、基礎生物學研究及個性化醫療提供了全新的技術平臺。

文章鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.73336

來源：北京航空航天大學