Science丨Src激酶通過胞吐作用來到腫瘤細胞表面成為抗體治療新靶點

撰文丨章臺柳

癌癥靶向抗體療法通常要求蛋白質(zhì)水平的顯著上調(diào)，或者產(chǎn)生一個全新的表位——例如源自基因突變或異常的翻譯后修飾。研究顯示，蛋白質(zhì)錯誤定位使得細胞內(nèi)蛋白能夠通過某種未知機制易位至細胞表面，使其成為 可靶向 的位點，挑戰(zhàn)了“只有經(jīng)典分泌型或膜結(jié)合型靶點才適合作為免疫治療候選對象”的傳統(tǒng)范式。

越來越多的證據(jù)表明，某些蛋白激酶會被分泌至細胞外空間，并發(fā)揮功能。理論上，這些胞外激酶有可能在腫瘤微環(huán)境中過度磷酸化細胞外蛋白，因為腫瘤微環(huán)境中細胞外 ATP 豐度極高（高達 1mM ），遠超激酶典型的米氏常數(shù)（ Km ，對底物的親和力）；而正常組織中的 ATP 水平約為 1 0 nM 。例如，將 CK 2 與 anti - HER 融合使其靶向過表達 HER 2 的細胞，導(dǎo)致多種癌癥相關(guān)表面蛋白（包括 CD 44 、 Galectin -3 和 CD 109 ）發(fā)生磷酸化。那么，這種胞外激酶是否存在 于 腫瘤細胞表面？

近 日 ， 來自 UCSF 的 James A. Wells 團隊 在 Science 雜 志上發(fā)表文章 Autophagolysosomal exocytosis inverts Src kinase onto the cell surface in cancer ，發(fā)現(xiàn)Src激酶作為一種通常通過其N-豆蔻酰脂質(zhì)錨定在質(zhì)膜內(nèi)葉的主調(diào)控激酶，在癌癥中（無論是體內(nèi)還是體外）通過自噬溶酶體胞吐作用（ALE）均發(fā)生了非經(jīng)典易位并翻轉(zhuǎn)至細胞表面，同時其他N-豆蔻酰化的細胞內(nèi)蛋白也以類似的方式被易位。 此外，在 原發(fā)性腫瘤中 也 發(fā)現(xiàn)這種細胞外膜相關(guān) Src （ eSrc ），并且基于抗 Src 抗體的療法在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小鼠異種移植模型中均介導(dǎo)了腫瘤細胞的殺傷。因此，以Src為代表的細胞內(nèi)N-豆蔻酰化蛋白，在癌癥中可以發(fā)生拓撲翻轉(zhuǎn)至細胞表面，并成為抗體療法的靶點。

研究人員 利用 更高分辨率的光鄰近標記蛋白質(zhì)組學（PLP）技術(shù)，如 μMap 和 MultiMap ，用于觸發(fā)短程反應(yīng)性生物素 - 卡賓標記， 來 描繪細胞表面蛋白質(zhì)組。利用 PLP 技術(shù)，鑒定出 738 種表面蛋白，從中篩選出 28 種蛋白激酶。 其中包括與癌癥相關(guān)的酪氨酸激酶 Src ，以及其他 Src 家族激酶： Fyn 、 Yes 和 Lyn 。 雖然之前有報道在癌細胞系的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)分泌的 Src ，但 Src 存在于細胞表面的現(xiàn)象還未報道過。鑒于這些酪氨酸激酶的存在，使用癌細胞系 HCC 1569 檢測細胞表面是否會發(fā)生酪氨酸磷酸化。使用流式細胞術(shù)檢測出細胞表面具有抗磷酸酪氨酸（ anti - pY ）信號，使用 Src 抑制劑可顯著降低 anti - pY 信號。此外在表面蛋白質(zhì)組學檢測到的 Src 家族激酶中， Src 在 HCC 1569 細胞中的轉(zhuǎn)錄水平最高。 同時鑒定出細胞表面存在 Src 激酶底物，使用重組 Src 激酶結(jié)構(gòu)域處理 HCC 1569 細胞可導(dǎo)致細胞增殖增加，表明 Src 介導(dǎo)的細胞外 pY 磷酸化會對細胞產(chǎn)生功能影響 。 細胞 質(zhì) Src （ cSrc ）通常通過其 N 端豆蔻酰化脂質(zhì)錨定在質(zhì)膜的內(nèi)葉 。為了確定胞外 Src （ eSrc ）的定位，使用 anti - Src 抗體來檢測細胞表面和培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中并未檢測到 Src ，而在細胞表面有強表達的 Src ， 這表明 cSrc 發(fā)生了明顯的翻轉(zhuǎn)，從質(zhì)膜內(nèi)葉轉(zhuǎn)移到了細胞表面。 對 多種癌癥來源細胞系、健康組織的永生化模型、健康供體來源的外周血單個核細胞（PBMCs）、健康人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）以及健康原代膀胱上皮細胞（BdECs） 檢測 eSrc 細胞表面表達，發(fā)現(xiàn) 大多數(shù)測試的永生化細胞系均表達 eSrc ； 而在健康供體的 PBMCs 、 HUVECs 或 BdECs 上則未檢測到 eSrc ，雖然細胞內(nèi)含有非常高水平的 cSrc 。在永生化及癌細胞系中， eSrc 的表達與總 Src 蛋白表達高度相關(guān)，但在健康的 HUVECs 和 BdECs 中未觀察到這種趨勢。搜集臨床腫瘤樣本，發(fā)現(xiàn)在 1 0 例原發(fā)性膀胱腫瘤的活腫瘤細胞均表達 eSrc 。

那么， Src 如何轉(zhuǎn)移至細胞表面？ 研究發(fā)現(xiàn)，在 自噬體生物發(fā)生過程中，來自質(zhì)膜的 cSrc （或來自細胞質(zhì)新近 N- 豆蔻酰化的 cSrc ）在自噬體閉合前會出現(xiàn)在其兩側(cè)；這些自噬體隨后被運輸并與溶酶體融合，導(dǎo)致 Src 位于自噬溶酶體的內(nèi)葉。隨后，通過溶酶體胞吐作用， eSrc 與其他溶酶體標記物一起展示在質(zhì)膜上。 其中 N - 豆蔻酰基團 可介導(dǎo) Src 與自噬體的結(jié)合。同時，研究人員對其他 N- 豆蔻酰 化蛋白進行檢測，在細胞表面鑒定出 3 4 種已知的 豆蔻酰 化蛋白，其中大多數(shù)尚未被注釋為胞外蛋白。通過活細胞流式細胞術(shù)獨立驗證了其中三種位于內(nèi)葉的 N- 豆蔻酰化蛋白（ Lyn 、 MARCKS 和 OAS2 ）確實存在于細胞表面 。即 N- 豆蔻酰化蛋白 可以通過 自噬溶酶體胞吐作用 的機制被非經(jīng)典地展示在細胞外 。

腫瘤細胞中 Src 表達會增加，同時自噬溶酶體胞吐作用介導(dǎo) eSrc 易位，這提示 eSrc 可能是一種潛在的腫瘤特異性抗原。研究人員利用 Fab 噬菌體文庫分離出一種針對人 Src 激酶結(jié)構(gòu)域的重組抗體（ Ab 1 ）， Ab 1 能結(jié)合表達 eSrc 的細胞，這種結(jié)合是特異性的。 進一步表征顯示， Ab 1 在荷瘤小鼠體內(nèi)循環(huán)過程中，在腫瘤中高度定位。隨后研究人員嘗試將 Ab 1 工程化為多種治療形式，來評估 eSrc 作為靶點的可及性和療效。將放射性同位素（如發(fā)射 α 粒子的 225 Ac ）通過螯合劑偶聯(lián)到抗體上，可能作為一種放射配體療法（ RLT ）實現(xiàn)強效殺傷，因為每個細胞只需少數(shù)幾次 α 粒子發(fā)射即可產(chǎn)生細胞毒性。在 HT-1080 荷瘤小鼠中，劑量僅為 0.6μCi 的 225 Ac 即可導(dǎo)致 腫瘤消退（ 16 只中有 2 只）或腫瘤生長速率的大幅降低（ 16 只中有 14 只）。初次給藥未觀察到急性毒性或體重減輕；然而，后續(xù)劑量觀察到了肝臟毒性，這與已知的小鼠一般輻射耐受性一致 。 通過將 Ab 1 的 Fab 片段與 CD 3 結(jié)合臂進行融合構(gòu)建了雙特異性抗體，來評估 eSrc 作為 T 細胞銜接器（ TCE ）靶點的潛力。體內(nèi)和體外的檢測顯示，抗 Src - TCE 顯著抑制腫瘤生長。由于 eSrc 缺乏內(nèi)吞途徑，其不適合作為 ADC 藥物開 發(fā)的靶點。即 eSrc 是一個基于抗體療法（特別是 TCE 和 RLT ）的具有治療相關(guān)性的靶點。

總的來說，這項研究揭示了以Src為代表的細胞內(nèi)N-豆蔻酰化蛋白，在癌癥細胞中通過自噬溶酶體胞吐作用發(fā)生非經(jīng)典易位并翻轉(zhuǎn)至細胞表面。同時鑒定出eSrc可作為癌癥靶向抗體療法的靶點。

https://doi.org/10.1126/science.aec1778

制版人： 十一

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