收藏！WB內(nèi)參蛋白如何選擇，期刊要求整膜和未裁剪膜長(zhǎng)什么樣？

【寫在前面】本文探討蛋白印跡內(nèi)參選擇、期刊對(duì)蛋白的要求以及蛋白整膜和未裁剪膜案例。記得分享收藏哦！

內(nèi)參的選擇

在western blot（WB）實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參蛋白是非常重要且必須的一部分，內(nèi)參蛋白通常是由細(xì)胞中管家基因編碼的蛋白，內(nèi)參保證了每個(gè)泳道中蛋白上樣量相同，不同泳道上的蛋白以相同的效率從凝膠轉(zhuǎn)到膜上，不同泳道上抗體孵育（包括一抗和二抗）、信號(hào)檢測(cè)都是一致的，是量化目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的重要標(biāo)尺。

插敘：前期我們有推送過蛋白印跡相關(guān)SCI期刊提出的要求（ 點(diǎn)擊下文閱讀 ）

1. 理想的內(nèi)參蛋白需滿足的條件

理想的內(nèi)參蛋白應(yīng)滿足以下條件：

（1）高度或中度表達(dá)，排除太高或低表達(dá)；

（2）在測(cè)試條件下內(nèi)參蛋白水平要保持恒定（與總蛋白量相比），例如，用特定藥物處理或未經(jīng)特定藥物處理、正常細(xì)胞和癌細(xì)胞、細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化、內(nèi)源性或外源性因素等；

（3）內(nèi)參蛋白和目的蛋白相對(duì)分子量有差異，內(nèi)參和目標(biāo)蛋白的檢測(cè)限都在動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，可在信號(hào)不飽和的情況下揭示內(nèi)參和目標(biāo)蛋白量的變化。

2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常用的內(nèi)參

全細(xì)胞或細(xì)胞漿中：GAPDH、β-Actin、β-Tubulin、Vinculin等；

細(xì)胞核中：Lamin B1、TBP、HDAC、PCNA、Histone H3等；

線粒體中：HSP60、COX IV等。

（1） GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，在糖酵解過程中將3-磷酸甘油醛進(jìn)一步磷酸化的一個(gè)酶，其編碼基因?qū)儆诠芗一颍瑥V泛表達(dá)于各種細(xì)胞組織中，且表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，故常常用來作為western blot的內(nèi)參。GAPDH會(huì)隨著組織老化，表達(dá)水平發(fā)生變化，因此不適合在年齡差別很大的組織樣本中作上樣內(nèi)參；缺氧時(shí)GAPDH聚集，表達(dá)上調(diào)，因此不能在涉及氧氣的相關(guān)研究中作為內(nèi)參；此外，GAPDH是糖酵解過程中的一個(gè)酶，故在研究腫瘤代謝過程時(shí)應(yīng)慎用。

（2） β-Actin：β肌動(dòng)蛋白，一種非肌型肌動(dòng)蛋白，也是一類常見的管家基因編碼的蛋白質(zhì)，主要功能是組成細(xì)胞的骨架。在各種組織中廣泛表達(dá)，表達(dá)水平相對(duì)恒定。但在胞質(zhì)分裂、內(nèi)吞或應(yīng)激等進(jìn)程中，細(xì)胞骨架重組信號(hào)刺激纖絲狀肌動(dòng)蛋白的片段化和解聚；在原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白被高度磷酸化；在凋亡條件下，心肌和骨骼肌中均能觀察到β-Actin的清除，因此，在相關(guān)研究中需要謹(jǐn)慎選擇。

（3） β-Tubulin：是Tubulin（微管蛋白）家族中的一員，微管蛋白在物種間高度保守，不同亞型的微管蛋白也有顯著的同源性。β-Tubulin是一類重要的管家基因編碼的蛋白，在細(xì)胞周期過程中扮演重要角色，廣泛用于作為WB內(nèi)參。微管蛋白是多種藥物的作用靶點(diǎn)，如抗癌藥物紫杉醇、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿，抗痛風(fēng)藥物秋水仙堿和抗真菌藥物灰黃霉素，因此有這些藥物作用時(shí)，內(nèi)參勿選Tubulin。

（4） Lamin B1：核纖層蛋白B1，核纖層蛋白是一種核膜結(jié)構(gòu)組分，用于支撐核被膜并參與細(xì)胞周期中核被膜的解體和再形成，對(duì)維持正常的細(xì)胞功能（如細(xì)胞周期控制、DNA復(fù)制）非常重要。Lamin B1在物種間高度保守，常用于有核被膜的樣品作為內(nèi)參。在細(xì)胞凋亡時(shí)，Lamin B1可被caspase剪切，另外，核纖層細(xì)胞B1基因LMNB1的復(fù)制與神經(jīng)系統(tǒng)疾病，成年期發(fā)病腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，在相關(guān)研究中應(yīng)予以注意。

總之，選擇內(nèi)參主要考慮以下方面：

（1）樣本種屬來源，哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，植物、昆蟲等來源樣本，適用的內(nèi)參各不相同；

（2）目的蛋白分子量，通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5kDa以上，此外，不同公司、同一公司不同貨號(hào)的抗體相對(duì)分子量大小也會(huì)有些差異；

（3）目的蛋白表達(dá)部位，全細(xì)胞和胞漿蛋白、胞核蛋白、核膜蛋白、線粒體蛋白等都有對(duì)應(yīng)的內(nèi)參蛋白供選擇；

（4）實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高；在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，Lamin B1等不 適合作為內(nèi)參；在加入抗癌和抗真菌藥物時(shí)，β-Tubulin的表達(dá)易受影響，不適合作為內(nèi)參；（5）組織特異性，不同內(nèi)參蛋白在不同組織中的表達(dá)可能不一樣，因此不同的組織應(yīng)選擇不同的內(nèi)參。

這里再放一張之前群友提供的內(nèi)參選擇圖，建議收藏~

一區(qū)期刊:要求的整膜、未裁剪的膜

蛋白印跡(WB)是一種基于抗體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測(cè)和定量靶蛋白，靶蛋白通常在從細(xì)胞或組織中提取的復(fù)雜混合物中。雖然有許多新的替代技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光和質(zhì)譜(MS)，但在一定程度上都有一定的局限性。ELISA缺乏加載控制，免疫熒光是一種原位技術(shù)，是半定量，而質(zhì)譜昂貴，取決于實(shí)驗(yàn)技術(shù)和條件。因此， WB仍然是實(shí)驗(yàn)室中最常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法 。然而，許多科學(xué)期刊已經(jīng)表達(dá)了對(duì)WB的擔(dān)憂，以努力減少潛在的錯(cuò)誤和增加可重復(fù)性的。在這里，我們將重點(diǎn)討論WB實(shí)驗(yàn)中的一些基本注意事項(xiàng)。因此，本指南旨在為未來的實(shí)驗(yàn)和論文寫作提供一個(gè)更新的、更簡(jiǎn)潔和可用的參考。

圖1：具有代表性的WB。a. WB的過飽和條帶。b. 空格（紅色虛線）表示印跡拼接。c. 切割印跡。d. 完整的印跡。

應(yīng)避免印跡的過飽和暴露，以將條帶信號(hào)強(qiáng)度（以光密度或熒光單位表示）保持在定量的線性范圍內(nèi)。建議進(jìn)行旨在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，特別是當(dāng)使用新的抗體或方法時(shí)。圖1a顯示了一個(gè)過飽和條帶的例子，它可能掩蓋或至少減少了樣品之間的差異。條帶之間的比較（無論是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）和與加載對(duì)照之間的歸一化只應(yīng)在相同的印跡上進(jìn)行。如果樣品數(shù)量超過一個(gè)單一凝膠的容量，則相同數(shù)量的對(duì)照樣品可以包含在單獨(dú)的凝膠中。然而，與這個(gè)對(duì)照樣本的比較仍然應(yīng)局限于同一印跡內(nèi)的樣本。

單獨(dú)的印跡永遠(yuǎn)不應(yīng)該合并到一個(gè)圖像中。如果在一個(gè)圖面板中并排組織了多個(gè)斑點(diǎn)，那么它們之間應(yīng)該有清晰可見的空間(如圖所示1b)。如果某些通道包含與主題無關(guān)的數(shù)據(jù)，可以從印跡中剪出，但完整的印跡仍應(yīng)根據(jù)期刊的要求提供給編輯或?qū)徃迦耍▓D1c，d)。然而，如果這些不相關(guān)的通道位于印跡的中間，它們不應(yīng)該被簡(jiǎn)單地移除。在這種情況下，凝膠應(yīng)該用重新組織的樣品重新運(yùn)行。在所有的印跡圖像上都應(yīng)顯示或標(biāo)記分子量標(biāo)記物的位置。如果印跡已被水平裁剪，則至少應(yīng)顯示兩個(gè)相鄰的標(biāo)記位置（即，在條帶的上方和下方），如圖所示1c。

舉例期刊對(duì)WB等結(jié)果的嚴(yán)格要求

現(xiàn)在越來越多的機(jī)構(gòu)及期刊注重原始數(shù)據(jù)，尤其提示不能認(rèn)為改變科學(xué)研究的結(jié)果。今天小編給大家介紹的這本SCI期刊 JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY（J CELL BIOCHEM） 便是提到了這一點(diǎn)，新更新的“作者須知”里面提到從2020年7月后都必須提供WB等的原始gel/blots圖片，且保證重復(fù)率，若發(fā)現(xiàn)有人為修改的地方一律予以拒稿。

1.報(bào)告WB和其他電泳結(jié)果：必須提供未經(jīng)處理的圖像

(1)自2020年7月以來，本期刊要求發(fā)表凝膠電泳和/或blots結(jié)果的論文作者提供原始的未經(jīng)處理的圖像。作者應(yīng)提交“原始圖像檢查”或可選擇發(fā)表未經(jīng)處理的圖像在附件信息中。

(2)每個(gè)圖片均需提供未切割的原始的免疫蛋白印跡。

來自J CELL BIOCHEM投稿要求

2.具體的Gel 和blots要求:

(1)所有圖像必須有足夠的分辨率和質(zhì)量。

(2)重新排列條帶或組合來自多個(gè)實(shí)驗(yàn)的圖像，如從多個(gè)印跡中拼接來制作特定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖像處理導(dǎo)致原始包含的信息失真或等的操作和編輯一般都是禁止的，期刊會(huì)立即拒稿，不會(huì)進(jìn)一步送審。

(3)這種行為可能被認(rèn)為是科學(xué)上的不端行為，需要進(jìn)一步的調(diào)查。

(4)對(duì)照的Marker、陽(yáng)性和陰性對(duì)照都應(yīng)該包括在每個(gè)gel/blots中。

(5)重復(fù)性很重要。重復(fù)的結(jié)果作者應(yīng)隨時(shí)準(zhǔn)備提交它們以供審查。重復(fù)的次數(shù)應(yīng)在圖注中清楚地標(biāo)明。

來自J CELL BIOCHEM投稿要求

3. 定量和半定量

(1)不能籠統(tǒng)地說某一蛋白的表達(dá)水平“高”或“低”。

(2)所有的量化必須對(duì)屬于線性響應(yīng)范圍內(nèi)的信號(hào)進(jìn)行 (例如，用于量化的波段不能過度曝光或過載)。

(3)不鼓勵(lì)對(duì)不同凝膠進(jìn)行定量比較；如有必須清楚說明。

來自J CELL BIOCHEM投稿要求

其他要求詳見：

https://onlinelibrary.wiley.com/page/journal/10974644/homepage/forauthors.html

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