病毒特輯，單純皰疹病毒篇

單純皰疹病毒是人類最常見(jiàn)的病毒之一，含有8種亞型，90%以上的人群至少感染其中一種單純皰癥病毒?？偨Y(jié)皰疹病毒學(xué)知識(shí)以形成自己的思路是很有必要的。因?yàn)槭强茖W(xué)性總結(jié)，所以不會(huì)像文學(xué)作品或者小說(shuō)那樣富有情節(jié)。但是我們會(huì)采用小說(shuō)的寫(xiě)作手法，力爭(zhēng)在尊重科學(xué)事實(shí)的基礎(chǔ)上做到嚴(yán)謹(jǐn)、有料、有味。為做到簡(jiǎn)潔，不再插入文獻(xiàn)。不做特別說(shuō)明的話，這里的病毒是指Ⅰ型人類單純皰疹病毒（HSV-1）。內(nèi)容以李琦涵、姜莉編著的《人類皰疹病毒的病原生物學(xué)》綠皮書(shū)為依據(jù)，參考著名病毒學(xué)家Bernard Roizman、David M. Knipe等主編的《費(fèi)氏病毒學(xué)》，舒紅兵教授主編的《抗病毒天然免疫》。

好了，開(kāi)始！

第一章 病毒入侵

事實(shí)上，病毒入侵是一個(gè)復(fù)合的概念。既可以是機(jī)體水平上（我們通常稱作感染），也可以是細(xì)胞水平。不過(guò)，通常意義上的病毒入侵是指病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程。下面，我們對(duì)兩個(gè)過(guò)程都做介紹。仔細(xì)想想，其實(shí)這兩個(gè)過(guò)程并不矛盾，因?yàn)椴《救肭质窍纫ㄟ^(guò)機(jī)體的防線，再進(jìn)入易感性細(xì)胞并最終完成其復(fù)制周期。

呼吸道、消化道和泌尿生殖道粘膜以及體表的皮膚構(gòu)成機(jī)體防止病毒入侵的物理屏障。同時(shí)，生物體還可以分泌能夠抵抗病毒感染的小分子多肽，如防御素（defensin）、溶菌酶（lysozyme）、導(dǎo)管素（cathelicidin）等組成機(jī)體防御的化學(xué)屏障。宿主對(duì)病毒的免疫反應(yīng)是天然免疫的第三道屏障。這些屏障共同組成機(jī)體抵抗病毒入侵的第一道防線。但是，病毒很狡猾，可以突破這些屏障，從而進(jìn)入機(jī)體。

皰疹病毒是一類以潛伏感染而著稱的病毒。它們有著自己的生存周期，從生到死，跟人類是一樣一樣滴。在病毒的復(fù)制周期中，病毒通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞是非常關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)，因?yàn)闆](méi)有入侵就沒(méi)有后面的故事?，F(xiàn)在，咱們就詳細(xì)說(shuō)說(shuō)病毒通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的全過(guò)程吧。相對(duì)于人體細(xì)胞而言，病毒很小很小，基本上是乒乓球或玻璃球與籃球的關(guān)系。

皰疹病毒顆粒的整體直徑為170~200nm（平均直徑185nm，加上棘突會(huì)增至225nm），而在人體細(xì)胞中，卵細(xì)胞平均直徑200μm，神經(jīng)細(xì)胞為100um（長(zhǎng)度可達(dá)0.7~1m），紅細(xì)胞為7um，白細(xì)胞為3~4um。因此，從體積的角度看，病毒顆粒與宿主細(xì)胞可以看成乒乓球和籃球，也就是說(shuō)，對(duì)病毒來(lái)說(shuō)，細(xì)胞是個(gè)龐然大物。那么，病毒是怎樣進(jìn)入細(xì)胞這個(gè)“龐然大物”的呢？簡(jiǎn)單地說(shuō)，這是由病毒囊膜蛋白及其定位于細(xì)胞表面的受體決定的。

如前所述，人體的所有細(xì)胞（器）表面都存在很多分子。免疫細(xì)胞（器）的表面分子能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式（PAMP），通常被稱為模式識(shí)別受體（PRR），可以特異性地識(shí)別“危險(xiǎn)信號(hào)”，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。一般情況下，非免疫細(xì)胞不參與免疫應(yīng)答。事實(shí)上，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，病毒正是利用這些表面分子入侵宿主細(xì)胞的。

在病毒學(xué)中，能夠直接與天然病毒粒子結(jié)合的細(xì)胞表面分子通常被稱為病毒受體（viral receptor）；能夠通過(guò)其他分子間接與天然病毒粒子或與第一步結(jié)合后已發(fā)生構(gòu)象改變的病毒粒子結(jié)合的細(xì)胞分子稱為共受體（coreceptor）。共受體可以是細(xì)胞表面分子，也可以是游離的細(xì)胞分子。病毒受體和共受體是病毒嗜性（viral tropism）的主要因素，是病毒感染早期的關(guān)鍵步驟，也決定病毒能否入侵細(xì)胞，因?yàn)椴《静荒芡ㄟ^(guò)細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層直接進(jìn)入細(xì)胞。

讀到這里，很多人肯定會(huì)產(chǎn)生困惑：宿主細(xì)胞可對(duì)入侵的病毒產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時(shí)，病毒又能通過(guò)受體和共受體進(jìn)入細(xì)胞，這難道不是悖論嗎？當(dāng)然不是，因?yàn)榘l(fā)揮免疫應(yīng)答的是免疫細(xì)胞，而病毒入侵的細(xì)胞大多是非免疫細(xì)胞，這兩類細(xì)胞的表面分子是不一樣的。類似的情況是外敵（病毒）入侵時(shí)，普通老百姓（非免疫細(xì)胞）和軍隊(duì)（免疫細(xì)胞）的反應(yīng)是不一樣的，因?yàn)槔习傩諞](méi)有防御能力，而軍隊(duì)是配有武器的，是可以直接反擊的。為了方便理解和情節(jié)的敘述，咱們先從宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答開(kāi)始吧！

在所有的信號(hào)通路中，目前研究最為透徹的是TLRs。TLR在免疫細(xì)胞中均高水平表達(dá)，而在非免疫細(xì)胞中表達(dá)較少。迄今已經(jīng)報(bào)道的人類TLR家族成員有11種，且均為跨膜蛋白。TLR分子在細(xì)胞內(nèi)的分布有所不同，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10定位于細(xì)胞膜，而TLR3、TLR7、 TLR8和TLR9定位于細(xì)胞內(nèi)體膜上。不過(guò)，在抗HSV-1感染中，主要是TLR2、TLR3和TLR9參與識(shí)別和抵御，而且整合素或許在其中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

另外，盡管HSV-1病毒是dsDNA病毒，其復(fù)制周期中也會(huì)產(chǎn)生dsRNA，后者進(jìn)一步激活RLR信號(hào)通路，即RIG-I和MDA5信號(hào)通路。同時(shí)，病毒入侵引起的危險(xiǎn)信號(hào)也會(huì)激活NLR信號(hào)通路，但是關(guān)于HSV-1感染與NLR信號(hào)通路的研究還比較少。關(guān)于HSV-1與天然免疫其他識(shí)別受體關(guān)系的研究則主要集中在DNA受體家族上，而不是C型凝集素受體家族或其他固有免疫特異性PRRs。HSV-1是dsDNA病毒，因而研究DNA受體的意義要比其他識(shí)別受體意義深遠(yuǎn)。

然而，這一切并不是病毒的本意，它們并不是要激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，而是要入侵人體的細(xì)胞并建立潛伏感染和再激活的裂解性感染，從而把自身的基因組DNA傳遞下去。因而，在機(jī)體免疫系統(tǒng)激活的同時(shí)，有些病毒微粒則逃過(guò)宿主的攻擊，在機(jī)體粘膜或體表的表皮細(xì)胞完成裂解性感染，其中又有一些沿著末梢神經(jīng)并上行至機(jī)體的三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)中“潛伏”下來(lái)。然而，無(wú)論是表皮細(xì)胞還是神經(jīng)細(xì)胞，它們自身的防御能力是極其有限的。病毒恰恰是利用這些非免疫細(xì)胞的低防御的弱點(diǎn)入侵細(xì)胞的。那么，具體入侵過(guò)程是怎樣的呢？病毒受體和輔助受體！

基于現(xiàn)有的研究資料，我們可以根據(jù)皰疹病毒感染所引起的病理形式大體將其分為兩類，即溶胞性感染和潛伏性感染：前者主要是皰疹病毒針對(duì)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等所產(chǎn)生的感染形式；而后者則多見(jiàn)于神經(jīng)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的感染。為什么皰疹病毒可以在同樣的機(jī)體環(huán)境中導(dǎo)致這樣兩種截然不同的感染形式，到目前為止尚無(wú)完善的解釋。

通常情況下，病毒是以液晶態(tài)的形式存在的，而不是細(xì)胞似的固態(tài)。最初的相互作用是靜電引力吸引，這一階段可逆、不穩(wěn)定。隨后，病毒能夠借助其表面的囊膜蛋白與細(xì)胞受體識(shí)別結(jié)合（粘附），然后通過(guò)膜融合（病毒囊膜與細(xì)胞膜都是雙層脂膜）入侵宿主細(xì)胞。這一過(guò)程，相對(duì)穩(wěn)定、不可逆。

對(duì)HSV-1病毒吸附宿主細(xì)胞膜表面受體的研究表明，HSV在進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中，要通過(guò)膜蛋白和多個(gè)細(xì)胞受體、輔助受體的結(jié)合，才能完成其介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合并使病毒進(jìn)入細(xì)胞的任務(wù) 。這樣的功能要求，使得病毒糖蛋白的多種糖蛋白分子必須綜合發(fā)揮互補(bǔ)作用。對(duì)此，現(xiàn)有的模型認(rèn)為，HSV在吸附細(xì)胞膜表面時(shí)，首先是糖蛋白gC和/或gB與細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）非特異性結(jié)合，這種結(jié)合使得病毒囊膜與細(xì)胞膜的空間距離縮短。隨后，gD則與胞膜上的特異性受體結(jié)合，后者可能為HVEM（Herpes virus entry mediator，腫瘤壞死因子家族成員），或是nectin-1和nectin2（免疫球蛋白超家族成員），還可能是由3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶催化硫酸肝素黏分子而產(chǎn)生的異構(gòu)體（3-OST-3）。這些結(jié)合進(jìn)一步啟動(dòng)gH、gL ，可能還有g(shù)K等，與上述蛋白一起，發(fā)揮促進(jìn)介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合的作用。在此過(guò)程中，還可能形成脂代結(jié)構(gòu)的（膽固醇和鞘磷脂分子富集而形成特定的微結(jié)構(gòu)域），實(shí)際上可以使膜內(nèi)的相應(yīng)受體蛋白發(fā)生動(dòng)力學(xué)變化，以促進(jìn)囊膜與胞膜的融合。同時(shí)，還可能引發(fā)某些特定的胞膜信號(hào)受體分子的結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)，從而向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些信號(hào)。

下面我們就以“Specific Association of Glycoprotein B with Lipid Rafts during Herpes Simplex Virus Entry”為例，探討病毒糖蛋白gB在病毒入侵細(xì)胞的具體作用。（在入侵過(guò)程中，宿主細(xì)胞中信號(hào)通路的激活以及其他囊膜蛋白的功能不是我們這里討論的重點(diǎn)。）

Bender 等人發(fā)現(xiàn)用膽固醇或脂類螯合劑處理細(xì)胞后，病毒感染細(xì)胞的能力明顯下降；再加膽固醇做Rescue實(shí)驗(yàn)時(shí)，病毒的感染能力又恢復(fù)到正常水平。但是，病毒感染之后，再用膽固醇或脂類螯合劑處理細(xì)胞時(shí)，病毒的復(fù)制并不受影響。因此，他們推斷，細(xì)胞表面的脂類和膽固醇分子與病毒入侵密切相關(guān)，但是與病毒的復(fù)制無(wú)關(guān)。我們已經(jīng)知道，病毒通過(guò)糖蛋白與細(xì)胞特定的受體識(shí)別、結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，那么病毒的糖蛋白與膽固醇或脂類有什么樣的關(guān)系呢？他們用梯度離心法獲得脂類密集區(qū)域（即脂滴）可能含有或結(jié)合的病毒蛋白或細(xì)胞蛋白，然后用WB檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂滴中并不含有病毒蛋白受體HVEM和nectin-1，但是他們檢測(cè)到了病毒蛋白gB。因此，他們推斷，gB與脂滴中的某種成分（或許是受體）相互作用，從而介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。這樣，我們也就更加接近真理。后來(lái)，Bender等人獲得了gB的晶體結(jié)構(gòu)，并在Science上發(fā)表文章。當(dāng)然，這些都是后話。那么，結(jié)合教材和文獻(xiàn)，我們可以推斷病毒入侵宿主細(xì)胞的大致過(guò)程：

人物：四處游蕩（布朗運(yùn)動(dòng)）的屌絲（病毒分子），朝九晚五的女白領(lǐng)（細(xì)胞）。

場(chǎng)景：屌絲走路從來(lái)不看路，一不小心，屌絲撞到了下班趕公交的女白領(lǐng)（女白領(lǐng)的車(chē)鑰匙忘記帶了所以只得擠公交；不過(guò)，今天工作進(jìn)展順利，雖是擠公交，她也很高興，以致被屌絲撞了一下還能還以微笑）屌絲愛(ài)上了女白領(lǐng)，狂追不舍，并最終以身相許。

情節(jié)：病毒蛋白通過(guò)靜電作用與宿主細(xì)胞在空間上接近，隨后，病毒通過(guò)其囊膜蛋白gB和gC與細(xì)胞表面的硫酸肝素糖分子非特異性結(jié)合。但是，這種結(jié)合并不穩(wěn)定。緊接著，病毒發(fā)生構(gòu)象調(diào)整，并通過(guò)gD與其受體HVEM（或者是nectin-1，亦或是3-OST-3)結(jié)合，此時(shí)的結(jié)合是特異性結(jié)合，結(jié)合牢固。這樣，粘附（Attachment）任務(wù)就完成了。接下來(lái)，gB與脂筏上的特定受體結(jié)合并觸發(fā)囊膜-細(xì)胞膜融合事件，同時(shí)，gH/gL異源二聚體被招募到融合起始處，gE、gG、gK、gJ也相繼加入。所有的病毒蛋白相互合作，協(xié)同完成病毒的入侵（Entry)。隨后，病毒脫掉囊膜，皮層蛋白、核衣殼及其包裹的核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞，即產(chǎn)生一個(gè)跟HSV-1入侵免疫細(xì)胞截然不同的結(jié)果。

第二章 高速公路

在上一節(jié)中，我們重點(diǎn)闡釋了HSV-1通過(guò)細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）、HVEM、免疫球蛋白超家族成員（nectin1和nectin2）進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程，而沒(méi)有展開(kāi)整聯(lián)蛋白在其中的重要作用。研究證明，HSV-1、HCMV及HHV-8等整聯(lián)蛋白均可以通過(guò)細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白進(jìn)入細(xì)胞。整聯(lián)蛋白及其偶聯(lián)蛋白FAK、GRAF、Rho-A等激活，常?？梢砸鸺?xì)胞內(nèi)微管動(dòng)力系統(tǒng)的功能變化。

真核細(xì)胞的骨架系統(tǒng)是由一大類纖維蛋白分子以不同形式組成的，其中包括肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)（MF）、微管系統(tǒng)（MT）和中間纖維系統(tǒng)（IF）。這些微管蛋白形成的骨架系統(tǒng)，一方面保證了細(xì)胞的特定結(jié)構(gòu)和特定運(yùn)動(dòng)形式，另一方面也為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的各種生化事件提供了相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)骨架和區(qū)域，保證各種功能穩(wěn)定有序進(jìn)行；同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)也限制了某些大分子復(fù)合物（其大小范圍在分子量500kDa和直徑50nm以內(nèi)）在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。病毒沒(méi)有獨(dú)自的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，必須借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，因此，病毒的遺傳物質(zhì)——dsDNA必定進(jìn)入細(xì)胞核。顯然，像皰疹病毒這種大分子復(fù)合物，當(dāng)其從細(xì)胞膜移向其增殖復(fù)制區(qū)域——細(xì)胞核時(shí)，必定會(huì)受到胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)的限制。病毒對(duì)此限制做出的反應(yīng)，則是利用細(xì)胞內(nèi)的大分子運(yùn)輸機(jī)理和自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將其遺傳物質(zhì)移至核內(nèi)。在此過(guò)程中，病毒蛋白自然會(huì)不可避免地與細(xì)胞的MF、MT和IF發(fā)生相應(yīng)的作用。

事實(shí)上，對(duì)許多病毒的研究也確實(shí)提供了明確的證據(jù)。這些病毒既包括桿狀病毒、痘苗病毒、SV40、腺病毒、HIV等，也包括皰疹病毒的多個(gè)成員，都能在進(jìn)入細(xì)胞后以各種方式通過(guò)與MT、MF網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的相互作用以完成自身在細(xì)胞內(nèi)的移動(dòng)。實(shí)驗(yàn)表明，多聚纖維蛋白分子抑制劑可以阻斷病毒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸作業(yè)，這充分證實(shí)病毒與此類蛋白的作用是病毒感染過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。【綠皮書(shū) 李琦涵】

我們以HSV-1為例講述這方面的研究進(jìn)展。

HSV-1的皮層蛋白VP22能夠誘導(dǎo)MT的聚集，并通過(guò)其UL34基因編碼的蛋白與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的動(dòng)力蛋白的中間鏈發(fā)生相互作用。目前，HSV-1衣殼體借助微管蛋白系統(tǒng)向核內(nèi)移動(dòng)的前導(dǎo)事件還不清楚，但是電鏡技術(shù)的連續(xù)觀察分析顯示，HSV-1在細(xì)胞核內(nèi)向細(xì)胞核區(qū)域移動(dòng)的過(guò)程的確與微管蛋白系統(tǒng)密切相關(guān)。首先，進(jìn)入細(xì)胞的HSV-1衣殼體與微管的相關(guān)動(dòng)力蛋白相結(jié)合；隨后，衣殼體則沿著微管網(wǎng)絡(luò)移向細(xì)胞核；在達(dá)到核膜時(shí)，HSV-1衣殼體則似乎是將所含的基因DNA注入細(xì)胞核內(nèi)。

當(dāng)然，形態(tài)學(xué)的觀察還不能提供完全準(zhǔn)確的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HSV-1衣殼體進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞后，細(xì)胞動(dòng)力蛋白的亞基DHC、DIC和動(dòng)力蛋白激活蛋白的亞基p150均聚集在衣殼體周?chē)?。此時(shí)，當(dāng)使用動(dòng)力蛋白抑制劑EHNA（erythro-9-3-[2-hydroxynonyl]adenine）處理細(xì)胞時(shí)，則可以明顯阻斷病毒在神經(jīng)細(xì)胞中的感染。同時(shí)，其他實(shí)驗(yàn)還表明，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)一種能破壞動(dòng)力蛋白激活蛋白復(fù)合體的分子，同時(shí)也是動(dòng)力蛋白激活蛋白亞基的dynamitin時(shí)，則使得HSV-1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)沿微管移動(dòng)的速度和效率都大大降低。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，與病毒衣殼體結(jié)合的細(xì)胞動(dòng)力蛋白亞基DHC頭部的結(jié)構(gòu)域，可經(jīng)ATP水解而產(chǎn)生構(gòu)象變化，使其自身及與其結(jié)合的病毒衣殼體移向微管的負(fù)電荷端。此過(guò)程同時(shí)得到其他動(dòng)力蛋白亞基DIC、DLIC和DLC的支撐作用。這一過(guò)程又得到動(dòng)力蛋白激活蛋白的啟動(dòng)作用。這些資料均證明，HSV-1通過(guò)與微管及其相關(guān)蛋白的結(jié)合而獲得趨向細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力，以實(shí)現(xiàn)自身到達(dá)細(xì)胞核的過(guò)程。【綠皮書(shū) p158】

事實(shí)上，與微管結(jié)合、參與病毒移動(dòng)的病毒蛋白均是由γ基因編碼的衣殼蛋白，而與皮層蛋白和囊膜蛋白沒(méi)有明顯的關(guān)系。早期研究認(rèn)為UL34編碼的衣殼蛋白可能是與微管蛋白結(jié)合的主要分子，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSV-1進(jìn)入細(xì)胞后，UL34蛋白會(huì)出現(xiàn)構(gòu)象變化，并與UL31和ICP5相互作用而暴露于衣殼體表面。這些蛋白同時(shí)與微管蛋白相互作用，從而保證病毒移向細(xì)胞核區(qū)域。但是酵母雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UL35編碼的VP26蛋白與動(dòng)力蛋白輕鏈RP3和Tctex1之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)一步的結(jié)合實(shí)驗(yàn)和熒光分析也驗(yàn)證這一點(diǎn)。盡管其他衣殼蛋白如VP5、VP11/12也可能參與該過(guò)程，但是VP26仍發(fā)揮主要作用。雖然上述研究均提供詳實(shí)的資料，但是對(duì)此機(jī)理的具體過(guò)程尚無(wú)定論。病毒沿著高速公路移動(dòng)的過(guò)程看似簡(jiǎn)單，但是實(shí)際上極其復(fù)雜，還有待于更加深入的研究。包括UL34和VP5在內(nèi)的衣殼蛋白在該過(guò)程中的作用也有待確認(rèn)。

同時(shí)，從對(duì)病毒結(jié)構(gòu)的初步分析中我們已經(jīng)知道，皰疹病毒的結(jié)構(gòu)組成包括幾乎各部分，即基因組DNA、核衣殼、皮層蛋白和外膜。核衣殼是病毒毒粒結(jié)構(gòu)的主要框架，它通常由10~20種蛋白組成（依據(jù)不同病毒而定），其中既有結(jié)構(gòu)蛋白，也有與病毒DNA裝載、核衣殼的形成相關(guān)的功能蛋白。核衣殼的外側(cè)為皮層蛋白，它們占據(jù)了病毒囊膜包裹空間的1/3。這些皮層蛋白組成一種類似網(wǎng)狀、沒(méi)有明顯分布規(guī)律的結(jié)構(gòu)，具有重要的生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)學(xué)意義（如VP16、UL41、UL37）。而最外層的囊膜則是一層來(lái)自宿主細(xì)胞質(zhì)體膜的結(jié)構(gòu)，但其上具有多種病毒糖蛋白(從gB到gN，沒(méi)有g(shù)A和gF)，在病毒吸附細(xì)胞受體，進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮重要作用（咱們前面已經(jīng)說(shuō)過(guò)）。病毒在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，棘突和囊膜會(huì)參與膜融合而被滯留在細(xì)胞膜上，因此實(shí)際上進(jìn)入細(xì)胞的病毒成分是部分皮層蛋白、核衣殼及其包裹的基因組。

接下來(lái)，我們結(jié)合文獻(xiàn)“Ultrastructural Visualization of IndividualTegument Protein Dissociation during Entry of Herpes Simplex Virus 1 into Humanand Rat Dorsal Root Ganglion Neurons”重點(diǎn)說(shuō)一下皮層蛋白（核衣殼咱們放到后面說(shuō)）在病毒移向細(xì)胞核過(guò)程的作用。

Anupriya等人采用廣角反褶積顯微鏡和透射免疫電子顯微鏡這兩種技術(shù)觀察皮層蛋白VP16、VP22、UL36和UL37在病毒向細(xì)胞核移動(dòng)過(guò)程中的角色。他們用標(biāo)記熒光蛋白的病毒（比如把YFP連在VP16的N末端），那么病毒表達(dá)的VP16就帶上了綠色熒光，然后用顯微鏡就可以看到了。WB（VP16一抗）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病毒感染細(xì)胞初期（0min），75%的病毒顆粒VP16陽(yáng)性；在感染30min時(shí)，只有較少的病毒顆粒VP16陽(yáng)性，而細(xì)胞質(zhì)和胞膜上游VP16分布較多。在感染2~4h時(shí)，病毒顆粒VP16陰性，細(xì)胞質(zhì)和核周有較多VP16分布。因此，在病毒移向細(xì)胞核的過(guò)程中，VP16從病毒顆粒上脫落，隨后分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（VP16具有核定位信號(hào)，我們將在后面介紹其功能）。

因此，我們可以推斷，在病毒從細(xì)胞膜沿著微管系統(tǒng)移向細(xì)胞核的過(guò)程中，大多數(shù)皮層蛋白病毒顆粒將脫落，暴露出核衣殼以便基因組釋放進(jìn)入細(xì)胞核。當(dāng)然，這些皮層蛋白的具體功能還有待進(jìn)一步研究，我們這里只是大體講述皮層蛋白的綜合效應(yīng)。

第三章 基因組入核

病毒入侵細(xì)胞，在含有基因組的衣殼體從細(xì)胞膜融合處移至細(xì)胞核周?chē)M(jìn)入細(xì)胞核前，必須將其核衣殼體脫掉才能使其dsDNA通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核?；蚪M進(jìn)入細(xì)胞核過(guò)程持續(xù)時(shí)間較短，因?yàn)椴《厩秩爰?xì)胞后即很快進(jìn)入細(xì)胞核。這也說(shuō)明，衣殼體很可能在移向細(xì)胞核的過(guò)程中即發(fā)生降解，或至少處于不穩(wěn)定狀態(tài)以便接近細(xì)胞核后基因組的迅速進(jìn)入。

研究表明，衣殼體移至細(xì)胞核附近，與核孔蛋白復(fù)合體相互作用，而后者與衣殼體蛋白的結(jié)合進(jìn)一步觸發(fā)衣殼體的構(gòu)象改變，從而促進(jìn)其降解以及隨后的基因組進(jìn)入細(xì)胞核過(guò)程。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)則證明，衣殼體降解和基因組進(jìn)入細(xì)胞核是密不可分的兩個(gè)連續(xù)的過(guò)程。

現(xiàn)有數(shù)據(jù)已證實(shí)，衣殼體蛋白UL6、UL25在衣殼體復(fù)合物降解過(guò)程具有極為重要的作用，其他衣殼蛋白的作用還有待于進(jìn)一步確認(rèn)。而且，由于皮層蛋白與衣殼體蛋白的密切相互作用，UL36和其他皮層蛋白也可能參與其中。其中，關(guān)于UL25的研究較為清楚。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，入侵宿主細(xì)胞后，皰疹病毒衣殼體沿微管網(wǎng)絡(luò)移至細(xì)胞核并定位于核孔復(fù)合體，隨后，病毒基因組釋放進(jìn)入細(xì)胞核之前。實(shí)驗(yàn)表明，在HSV-1感染細(xì)胞中有衣殼蛋白與核孔蛋白CAN / Nup214相互作用的證據(jù)，而沉默CAN/ Nup214后，可延遲病毒基因組在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的起始。實(shí)驗(yàn)還表明，UL25與CAN/ Nup214和hCG1相互作用，并結(jié)合UL36和pUL6。這兩者分別是皰疹病毒顆粒組分中感染起始和病毒基因組釋放的重要蛋白。盡管這些結(jié)果確定CAN/ Nup214可作為皰疹病毒衣殼體的核受體，但是其配體尚不清楚，而UL25可能只是提供了衣殼體蛋白和核受體蛋白的場(chǎng)所，隨后病毒DNA釋放到細(xì)胞核的過(guò)程也不明確。

還有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，病毒基因組的釋放并不需要其衣殼體降解，而是在通過(guò)衣殼體上的出口后，以雙股單鏈DNA的形式進(jìn)入細(xì)胞核。衣殼體不進(jìn)入細(xì)胞核，似乎也不再發(fā)揮其他生物學(xué)功能。這個(gè)過(guò)程主要是UL6在發(fā)揮作用。但是，事實(shí)上，進(jìn)入細(xì)胞核的病毒基因組，根本無(wú)法獨(dú)自直接開(kāi)始其復(fù)制過(guò)程，而是先由VP16參與轉(zhuǎn)錄激活后才能開(kāi)始復(fù)制。這說(shuō)明皮層蛋白進(jìn)入細(xì)胞核是通過(guò)不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞核的，盡管目前還沒(méi)有基因組和皮層蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的直接證據(jù)。

目前，有關(guān)基因組進(jìn)入細(xì)胞核研究最多的當(dāng)屬HIV。雖然HIV是逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒，但是在其復(fù)制過(guò)程會(huì)產(chǎn)生dsDNA，其衣殼體外也有囊膜包裹，因此對(duì)皰疹病毒的基因組進(jìn)入細(xì)胞核研究具有很好的啟示作用。當(dāng)然，這僅僅是研究的一個(gè)切入點(diǎn)。現(xiàn)有的HSV-1脫衣殼步驟如下：（1）入侵細(xì)胞的衣殼體定位至核孔復(fù)合物（NPC）；（2）NPC的開(kāi)放以及高壓力病毒基因組釋放；（3）病毒基因組通過(guò)NPC轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核 (19)。最近有研究表明，MxB可以與HIV衣殼體結(jié)合，阻止HIV脫衣殼，從而抑制HIV的復(fù)制 。那么，MxB是否抑制HSV-1脫衣殼是值得研究的問(wèn)題。

由于脫衣殼過(guò)程與病毒的核衣殼結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，也會(huì)讓我們想到古代成語(yǔ)——金蟬脫殼。下面我們簡(jiǎn)要介紹一下衣殼體的結(jié)構(gòu)。

衣殼體均由162個(gè)殼微粒組成一個(gè)二十面體的立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其中有150個(gè)是六聚體，12個(gè)是五聚體。這些殼微粒具有皰疹病毒的特征性結(jié)構(gòu)，即每個(gè)殼微粒的縱切面中間均有一直徑4nm、長(zhǎng)15nm的孔道。在五聚體和六聚體亞單位中，存在一種主要的衣殼蛋白VP5（UL19基因編碼），以及兩種次要的衣殼蛋白VP19c（UL38基因編碼）和VP23（UL18基因編碼）。兩種次要的衣殼蛋白形成三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，通常含有一個(gè)VP19c和兩個(gè)VP23。另外，還有一種次要的衣殼蛋白VP26，位于六聚體的外緣。由這些結(jié)構(gòu)蛋白組成的五聚體和六聚體亞單位裝配成為病毒核衣殼之間，需要一個(gè)內(nèi)部的支架蛋白pre-rp22a(由UL26.5基因編碼)，這一蛋白與核衣殼體主要的結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用，決定了完整的核衣殼體趨向成熟。核衣殼體的成熟過(guò)程，咱們后面會(huì)說(shuō)到?！緟⒁?jiàn)綠皮書(shū)】

密度梯度離心實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HSV感染細(xì)胞的過(guò)程中，常可見(jiàn)三種形式的HSV核衣殼，即A、B、C三型。A型核衣殼是空衣殼，其中無(wú)DNA，也無(wú)DNA結(jié)合蛋白；B型核衣殼有DNA結(jié)合蛋白，少有或沒(méi)有DNA；C型核衣殼有DNA，但少有或沒(méi)有DNA結(jié)合蛋白。對(duì)這些不同形式的核衣殼的分析表明，C型核衣殼因含有完整的病毒DNA，可以發(fā)育為具有感染力的病毒顆粒；B型核衣殼則能夠進(jìn)一步裝載DNA而轉(zhuǎn)化成C型核衣殼；A型核衣殼則可能因?yàn)槿狈NA結(jié)合蛋白而始終以空衣殼的形式存在。關(guān)于核衣殼，我們能夠說(shuō)的就這么多了，但是核衣殼在病毒從細(xì)胞膜移向細(xì)胞核的過(guò)程中的作用還有待于進(jìn)一步研究，比如多功能蛋白UL13和Us3的作用等等。

金蟬脫殼
原文：存其形，完其勢(shì)①；友不疑，敵不動(dòng)。巽而止蠱②。

注釋：①存其形，完其勢(shì)，保存陣地已有的戰(zhàn)斗形貌，進(jìn)一步完備繼續(xù)戰(zhàn)斗的各種態(tài)勢(shì)。②巽而止蠱：語(yǔ)出《易經(jīng)?蠱》卦。艮在上卦，為靜；巽為下卦，為謙遜，故說(shuō)“謙虛沉靜”，“弘大通泰”是天下大治之象。

譯文：保存陣地的原形，造成還在原地防守的氣勢(shì)，使友軍不懷疑，敵人也不敢貿(mào)然進(jìn)犯。在敵人迷惑不解時(shí)，隱蔽地轉(zhuǎn)移主力。）

第四章 心有所屬

好了，我們已經(jīng)走了一段路了。那么，咱們前面說(shuō)的屌絲（病毒）愛(ài)上女白領(lǐng)（宿主細(xì)胞）也應(yīng)該有下文了。咱們上次說(shuō)到屌絲撞到女白領(lǐng)，一見(jiàn)鐘情并以身相許。在屌絲的狂轟濫炸之下，女白領(lǐng)終于投降。今天是他們大喜的日子。他們結(jié)婚了。病毒千辛萬(wàn)苦的努力之后，也終于到了最為關(guān)鍵的時(shí)刻——洞房花燭。

在這里，我還要誠(chéng)實(shí)的告訴大家，到目前為止，病毒基因組復(fù)制的具體機(jī)制并不清楚。現(xiàn)有的研究主要是與基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)和各種特定功能所需修飾相關(guān)的核內(nèi)組合體——ND10（nuclear domain）。

ND10在形態(tài)上曾被叫做核小體，也稱作早幼粒白細(xì)胞白血病蛋白體（PML）,它在核內(nèi)以直徑0.2~1um的核狀結(jié)構(gòu)存在，數(shù)量范圍約為5~30個(gè)。有實(shí)驗(yàn)表明，HSV-1病毒在感染細(xì)胞時(shí)，其基因組DNA常常附著于PML小體上。而且，DNA的復(fù)制過(guò)程亦與PML小體具有拓?fù)鋵W(xué)上的相關(guān)關(guān)系。同時(shí)，其他病毒，包括HCMV和腺病毒、SV40等也具有基因組DNA附著于PML的特性。這些現(xiàn)象似乎提示，當(dāng)病毒移至細(xì)胞核膜，將其基因組DNA經(jīng)核孔注入細(xì)胞核內(nèi)后，病毒基因組DNA分子能夠以PML小體為靶部位。而且，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，僅僅是那些能夠最終形成完整增殖性感染的病毒，才會(huì)出現(xiàn)其基因組DNA靶向移動(dòng)至PML并停留于此。這似乎意味著，病毒基因組DNA停留于PML小體，是因?yàn)椴《綝NA需要PML小體的相關(guān)組成成分為其提供一個(gè)高效率轉(zhuǎn)錄的活性部位。有關(guān)HSV-1的研究表明，HSV-1基因組DNA定位于PML的基本前提是病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄起始子Oris、具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的ICP0和ICP27蛋白以及PML小體的組分之一Daxx?！緟⒁?jiàn)綠皮書(shū)】

另外，PML還參與皰疹病毒基因DNA的復(fù)制過(guò)程，但具體機(jī)制尚在進(jìn)一步研究中。其中，研究較多的是病毒蛋白ICP0對(duì)PML小體降解作用。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HSV-1感染細(xì)胞時(shí)，常常會(huì)出現(xiàn)PML小體被破壞的現(xiàn)象。ICP0可同時(shí)與泛素相關(guān)蛋白酶體和PML小體結(jié)合而破壞PML小體，隨后，其組分常在病毒基因組復(fù)制區(qū)域繼續(xù)聚集，這些現(xiàn)象提示病毒基因的復(fù)制需要PML小體的相關(guān)成分。但具體是哪一成分，則至今都沒(méi)有明確的回答。但是，又有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。PML小體的破壞與否似乎并非是病毒DNA復(fù)制的絕對(duì)條件，因?yàn)镮CP0缺失病毒仍然能夠在細(xì)胞中正常進(jìn)行DNA的復(fù)制，PML小體依然可以識(shí)別病毒基因組DNA復(fù)制的區(qū)域?；谶@樣的觀察，有人認(rèn)為，PML小體對(duì)病毒基因DNA復(fù)制的進(jìn)行具有特殊意義，但不是絕對(duì)必需的。

更深入的研究提示，HSV-1的復(fù)制的確需要PML小體，因?yàn)镠SV-1基因中形成復(fù)制的區(qū)域仍然是其基因與PML小體的相關(guān)結(jié)構(gòu)。而這一區(qū)域缺失包括了ICP0和PML小體的相關(guān)結(jié)構(gòu)。另外，只有在這一結(jié)構(gòu)中，HSV-1基因DNA的復(fù)制才是最有效率的。同時(shí)，功能分析也提示，被皰疹病毒相關(guān)蛋白破壞的PML小體成分，常可以通過(guò)抑制依賴于PML小體的抗病毒反應(yīng)而加強(qiáng)病毒的復(fù)制。

下面我們簡(jiǎn)要總結(jié)一下病毒基因組DNA入核后的一系列反應(yīng)。病毒基因組入核后，基因組DNA靶向定位于PML小體。事實(shí)上，PML小體具有抗病毒作用，然而病毒的皮層蛋白ICP0具有E3泛素酶作用，可以破壞PML的結(jié)構(gòu)，釋放出病毒可以用于復(fù)制的細(xì)胞因子（不清楚具體因子是什么）。實(shí)驗(yàn)證明，感染細(xì)胞的病毒線性DNA很快形成環(huán)狀的復(fù)制中間體。隨后，病毒有可能同時(shí)以δ復(fù)制和θ復(fù)制的方式開(kāi)始DNA復(fù)制過(guò)程（具體的復(fù)制過(guò)程咱們后面會(huì)說(shuō)），從而完成病毒基因組DNA的復(fù)制。

第五章：始于足下（VP16的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)作用）

說(shuō)實(shí)話，從VP16啟動(dòng)病毒基因組并開(kāi)始表達(dá)蛋白到病毒顆粒包裝完成直至釋放才是病毒學(xué)的核心內(nèi)容，因?yàn)槲覀冊(cè)谇懊嬷v到的所有的病毒蛋白都是在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的條件下產(chǎn)生的。

當(dāng)皰疹病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在一系列分子生物學(xué)事件的支持下，其基因組DNA將穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核，這一過(guò)程依賴于病毒核衣殼的特定蛋白分子與細(xì)胞內(nèi)某些分子，如微管蛋白的相互作用（咱們前面已經(jīng)加以討論）。當(dāng)病毒基因DNA分子進(jìn)入細(xì)胞核后，將出現(xiàn)一個(gè)由宿主細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體介導(dǎo)，并由病毒皮層蛋白VP16啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)事件。這一事件涉一些胞內(nèi)蛋白分子，如Oct-1、HCF等，這些細(xì)胞蛋白與病毒蛋白形成的聚合體多蛋白復(fù)合物，將結(jié)合至皰疹病毒基因組中α基因的啟動(dòng)子區(qū)域，以順式激活的方式啟動(dòng)5個(gè)α基因產(chǎn)物（以HSV-1為例），即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)病毒基因組線性轉(zhuǎn)錄過(guò)程。隨后，β基因產(chǎn)物開(kāi)始產(chǎn)生（病毒DNA復(fù)制相關(guān)酶均為β基因產(chǎn)物），病毒基因DNA分子也開(kāi)始復(fù)制。當(dāng)γ基因產(chǎn)物（多為結(jié)構(gòu)蛋白）也順序被轉(zhuǎn)錄并翻譯形成后，復(fù)制完整的基因即可作為子代病毒的基因組用于新病毒的裝配合成了。

現(xiàn)有資料證明，在HSV病毒進(jìn)入細(xì)胞后，使α基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的主要病毒功能蛋白就是VP16。VP16對(duì)HSVα基因的轉(zhuǎn)錄激活，主要針對(duì)幾個(gè)病毒即刻早期基因，即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的編碼基因5’端非編碼區(qū)中的一個(gè)特定序列——TAATGARAT（R為任何嘌呤堿基核苷酸）起作用。但是，在DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，VP16并未顯示出與任何DNA序列結(jié)合的能力，而對(duì)真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的認(rèn)識(shí)已經(jīng)清楚地表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與DNA特定功能基序的結(jié)合，是發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用發(fā)的結(jié)構(gòu)前提。因此，既然VP16也具有轉(zhuǎn)錄激活功能，則其必定有相應(yīng)的輔助因子。實(shí)驗(yàn)證明，VP16對(duì)特定DNA序列TAATGARAT的特異作用是基于其與胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄蛋白Oct-1的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。但實(shí)驗(yàn)表明，在只有這兩個(gè)成分存在的情況下，VP16與Oct-1的結(jié)合作用非常弱，并不能形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)，除非有第三個(gè)蛋白——同屬于胞內(nèi)的調(diào)控蛋白——HCF的存在。但有意思的是，HCF既不與TAATGARAT結(jié)合，也不是從結(jié)構(gòu)上連接VP16和Oct-1、它的存在意義在于誘導(dǎo)VP16出現(xiàn)一個(gè)構(gòu)象的變化，使得VP16呈現(xiàn)一個(gè)新的空間結(jié)構(gòu)而以較高的親和力與Oct-1以及TAATGARAT序列立體結(jié)合。HCF激活VP16以形成一個(gè)包括HCF、VP16和Oct-1的復(fù)合體，特異識(shí)別并結(jié)合TAATGARAT序列的機(jī)理和過(guò)程不清楚，但的確是VP16產(chǎn)生HSVα基因轉(zhuǎn)錄激活的基本前提。因此，在某種意義上，我們可以認(rèn)為，HCF的存在及功能對(duì)于VP16功能的發(fā)揮具有決定性意義。一些尚未肯定的實(shí)驗(yàn)表明，在缺乏Oct-1的情況下，如Oct-1基因缺失的細(xì)胞中，VP16和HCF的結(jié)合也依然可以誘導(dǎo)HSVα基因的基礎(chǔ)表達(dá)。但在HCF缺乏的情況下，則VP16的轉(zhuǎn)錄激活功能將完全喪失。

早期的研究對(duì)Oct-1作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)特定序列TAATGARAT的結(jié)合在VP16轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程中的作用也有過(guò)詳細(xì)的分析。從現(xiàn)有資料看，由Oct-1介導(dǎo)的VP16的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制應(yīng)該是HSVα基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的主流機(jī)制。對(duì)Oct-1及其他家族成員的細(xì)胞生物學(xué)結(jié)構(gòu)分析表明，這個(gè)具有特定保守序列的蛋白有兩個(gè)結(jié)合DNA的亞結(jié)構(gòu)域，即POUs和POUn，前者指能與特定（specific）DNA序列結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，而后者為能與同源DNA序列（homeo-）結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步的生物化學(xué)分析表明，VP16和Oct-1結(jié)合的特定部位在POUn區(qū)域中，而對(duì)于VP16來(lái)說(shuō)，其與Oct-1結(jié)合的區(qū)域也在VP16-Oct-1-HCF復(fù)合體結(jié)合DNA靠近α基因啟動(dòng)子的部位。另外，VP16中的GARAT基序在該序列與Oct-1結(jié)合的過(guò)程中能夠誘導(dǎo)POU結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化而引導(dǎo)Oct-1-VP16-HCF復(fù)合體的形成，而后者直接導(dǎo)致了VP16對(duì)α基因啟動(dòng)子序列的識(shí)別。

作為皮層蛋白，當(dāng)HSV-1進(jìn)入細(xì)胞后，VP16即可以病毒的結(jié)構(gòu)成分而發(fā)揮作用。有實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)以重組病毒方式將VP16和GFP融合表達(dá)時(shí)，可以在病毒感染細(xì)胞后見(jiàn)到VP16主要聚集在細(xì)胞核與病毒復(fù)制相關(guān)的區(qū)域，但同時(shí)可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在，而且先是呈彌散狀，在聚集到類囊狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞器中，如高爾基體。同時(shí)，作為結(jié)構(gòu)蛋白，VP16需要在病毒組裝時(shí)進(jìn)入子代病毒的顆粒中，畢竟HSV-1的皮層蛋白組分約占病毒核衣殼體積的50%。另外，有實(shí)驗(yàn)明確提示，VP16分子上的特定區(qū)域可以與RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物中的亞基TFⅡB發(fā)生相互作用，而這一作用與VP16的轉(zhuǎn)錄激活功能直接相關(guān)。還有實(shí)驗(yàn)表明，VP16可以與TBP、SAGA組氨酸乙?；笍?fù)合物發(fā)生相互作用，是以綜合多重作用蛋白質(zhì)的方式發(fā)揮功能的。目前，大家公認(rèn)，VP16通過(guò)和Oct-1及HCF的結(jié)合只是其主要的作用方式，而與其他蛋白的相互作用，則形成其轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控機(jī)制?！緟⒁?jiàn)綠皮書(shū)】

我們必須說(shuō)明，VP16只能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活，而不具備DNA結(jié)合作用，所以有人就提出一個(gè)問(wèn)題，HSV在進(jìn)化過(guò)程中，為什么沒(méi)有進(jìn)化產(chǎn)生一個(gè)既含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，又含有特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VP16呢？這樣的蛋白不是具有更高的轉(zhuǎn)錄效率嗎？為什么必須依靠于兩個(gè)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的特異結(jié)合呢？這個(gè)問(wèn)題還要進(jìn)一步的驗(yàn)證，但很可能是病毒的一種生存策略。當(dāng)然，由于VP16是一種多功能蛋白，我們的探索還將繼續(xù)。

信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VP16可參與逃逸宿主的天然免疫作用。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，VP16能夠顯著抑制IFN-β和NF-kB信號(hào)通路。那么，VP16是如何發(fā)揮抑制作用的呢？接下來(lái)，用VP16分別與信號(hào)通路的接頭蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度的變化，發(fā)現(xiàn)VP16在IRF-3（使其二聚化）而不是IRF-7水平抑制IFN-β的表達(dá)；隨后，在HSV-1感染條件下，采用Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到VP16和IRF3相互作用。當(dāng)然，VP16的其他功能，還有待于進(jìn)一步研究。

第六章：即刻早期蛋白

接下來(lái)，咱們先來(lái)介紹一下VP16轉(zhuǎn)錄激活后誘導(dǎo)表達(dá)的第一個(gè)即可早期蛋白——ICP0。說(shuō)起這個(gè)蛋白，我忽然想到“多才多藝”這個(gè)詞，為什么呢？因?yàn)镮CP0是一個(gè)多功能蛋白。多才多藝常用于形容才子，比如江南四大才子，唐伯虎、祝枝山、文征明和徐禎卿。他們個(gè)個(gè)琴棋書(shū)畫(huà)，無(wú)所不知，無(wú)所不曉，博古通今，多才多藝。我們?nèi)绻o皰疹病毒學(xué)評(píng)選四個(gè)才子的話， ICP0一定榜上有名，而且是“四大才子”之首，相當(dāng)于唐伯虎。

不過(guò)，作為一種病毒蛋白，ICP0可沒(méi)有唐伯虎那種花前花后、酒醉酒醒的生活，它只記得它的使命——轉(zhuǎn)錄調(diào)控。現(xiàn)有的資料表明，ICP0是一個(gè)能在病毒感染過(guò)程中表現(xiàn)多種不同功能的病毒蛋白，它不僅可與某些病毒蛋白發(fā)生相互作用并與病毒早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，它還可對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。因此，有報(bào)道認(rèn)為，ICP0是一種具有普遍意義的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。

對(duì)ICP0在病毒感染過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)分析表明，新合成的ICP0分子通常出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)或核結(jié)構(gòu)附近的位置，這些位置相對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)點(diǎn)就是ND10。其主要組成成分即為早幼粒細(xì)胞白血病蛋白體（PML），而PML又可結(jié)合其他在染色體構(gòu)象調(diào)控（如組蛋白乙?；?、去乙?；┲衅鹱饔玫牡鞍?，如Daxx、CBP、sp100等。這些蛋白在與PML結(jié)合的過(guò)程中可以呈現(xiàn)天然構(gòu)象或是小分子泛素化修飾的狀態(tài)。很明顯，ICP0在這些部位的聚集及與相關(guān)分子的相互作用，提示其可能影響細(xì)胞內(nèi)某些與染色體基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的調(diào)控因子。隨著感染細(xì)胞內(nèi)ICP0量的增加，其可逐漸在細(xì)胞核內(nèi)彌散并充滿整個(gè)細(xì)胞核。感染后期，尤其是病毒基因組DNA合成已經(jīng)完畢后，該蛋白則可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)檢出，這一現(xiàn)象事實(shí)上是ICP0通過(guò)某種尚未確定的機(jī)制（可能是與細(xì)胞周期蛋白D3）由細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)致的。還有報(bào)道認(rèn)為，ICP0從細(xì)胞核移向細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)散過(guò)程中，同時(shí)促進(jìn)了ND10結(jié)構(gòu)的解聚及其組分，如PML、sp100等的降解。但這兩個(gè)事件是否有因果關(guān)系尚需進(jìn)一步確認(rèn)。還有實(shí)驗(yàn)提示，ICP0和細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)組蛋白的乙?；w系成分，如PCAF、CBP（二者也存在于PML聚集體中）之間有相互作用。而且，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的分析表明，這樣的結(jié)合可以細(xì)胞內(nèi)乙?；到y(tǒng)HAT的功能，并通過(guò)這一功能的改變而對(duì)病毒基因和細(xì)胞內(nèi)某些基因進(jìn)行調(diào)控，當(dāng)然，這一初步結(jié)果尚需證實(shí)。

對(duì)ICP0功能的綜合分析還進(jìn)一步提示，ICP0可能作為一種泛素連接酶而參與了細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶途徑，具體表現(xiàn)為，首先是ICP0的C端結(jié)構(gòu)（594-646位區(qū)）可以特異性地與USP7，即皰疹病毒自身編碼的泛素特異性蛋白酶相互作用；其次，ICP0可以促進(jìn)幾種細(xì)胞蛋白的降解，并能誘導(dǎo)偶聯(lián)泛素在其定位基礎(chǔ)上的聚集，而且這一作用，正是由ICP0分子中的環(huán)指結(jié)構(gòu)所決定的；最后，ICP0還能以一種特定的動(dòng)力學(xué)方式，在感染細(xì)胞中和26S蛋白酶體產(chǎn)生相互作用，在蛋白酶體抑制劑存在時(shí)，ICP0即可穩(wěn)定地結(jié)合在該蛋白酶體之上。我們知道，ICP0的環(huán)指結(jié)構(gòu)具有明確的E3泛素連接酶的功能，而且，當(dāng)其在感染細(xì)胞中和26S蛋白酶體結(jié)合時(shí)，又不被該蛋白酶體所降解。因而，從理論上講，ICP0應(yīng)該是病毒在感染細(xì)胞中為控制細(xì)胞的泛素系統(tǒng)而編碼的組分之一，如果這個(gè)可能性的確存在的話，那么，病毒的這一設(shè)置，顯然是基于其本身的增殖策略而具有針對(duì)性的。前面談到，ICP0在感染細(xì)胞內(nèi)可以引起PML、sp100等蛋白的降解，進(jìn)一步的分析也證實(shí)，ICP0可能通過(guò)不同的方式，包括需要病毒蛋白編碼的USP7的參與，利用泛素-蛋白酶體途徑，降解PML、cdc34和sp100。而在這個(gè)過(guò)程中，ICP0的環(huán)指結(jié)構(gòu)發(fā)揮了重要的泛素連接酶作用。

那么，作為HSV-1的一個(gè)即刻早期蛋白，ICP0為何要以如此復(fù)雜的方式參與這些細(xì)胞蛋白的降解，這樣一個(gè)特定細(xì)胞蛋白降解的生物學(xué)事件，對(duì)病毒增殖的意義何在？有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，盡管ICP0在其從細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程中引發(fā)PML的降解，但這一事件還有病毒蛋白UL13和Us3的參與。不過(guò)，PML的降解并不是病毒感染時(shí)其基因表達(dá)的重要基礎(chǔ)，可能和α基因表達(dá)之后的其他病毒基因表達(dá)有關(guān)。

當(dāng)然，我們知道PML、sp100作為ND10結(jié)構(gòu)中的重要組分，與細(xì)胞染色體組蛋白去乙酰化過(guò)程相關(guān)，既然如此，那么ICP0降解這些與去乙?；δ芟嚓P(guān)的蛋白質(zhì)是否是為了增強(qiáng)或利用細(xì)胞內(nèi)與此相對(duì)應(yīng)的乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）系統(tǒng)呢？因?yàn)榧?xì)胞分子生物學(xué)研究已明確，乙?；瘜?duì)于相當(dāng)數(shù)量的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要的意義。盡管這些實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步深入的證實(shí)，但其確實(shí)提示了ICP0在病毒基因調(diào)控中發(fā)揮的特殊功能。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提示，ICP0環(huán)指結(jié)構(gòu)的破壞所引起的最明顯而直接的結(jié)果就是ND10結(jié)構(gòu)能保持完整，而其中的幾個(gè)蛋白，如前面所提到的sp100、PML等也會(huì)繼續(xù)保持其穩(wěn)定狀態(tài)。而這一穩(wěn)定的結(jié)果，尤其是PML蛋白的穩(wěn)定則可使細(xì)胞對(duì)在感染過(guò)程中產(chǎn)生的干擾素的敏感性的降低，這實(shí)際上增加了病毒對(duì)機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的抗病毒反應(yīng)的抵抗力（似乎矛盾，ICP0破壞降低了干擾素的敏感性？）。但是，這種抵抗力的增強(qiáng)和病毒基因或細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄激活功能有何聯(lián)系，仍然不得而知。另外，還有報(bào)道認(rèn)為，由于ND10在ICP0的作用下破壞，使得該結(jié)構(gòu)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子得以釋放，從而加強(qiáng)了病毒基因和細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。不過(guò)，ICP0的轉(zhuǎn)錄激活作用對(duì)那些以轉(zhuǎn)染或感染方式引入細(xì)胞的基因并無(wú)明顯作用，這提示細(xì)胞中并不存在由于ICP0破壞ND10結(jié)構(gòu)而釋出的轉(zhuǎn)錄因子。而其他的一些研究認(rèn)為，ICP0的真正效應(yīng)可能是類似于組蛋白去乙?；傅囊种苿?，可增強(qiáng)組蛋白的乙?；瑥亩铀倩虻霓D(zhuǎn)錄激活作用。這是個(gè)有意思的問(wèn)題，但要證實(shí)這一點(diǎn)，則必須首先確定以感染或轉(zhuǎn)染方式引入細(xì)胞的病毒基因DNA或其他DNA，是否在進(jìn)入細(xì)胞后立即細(xì)胞組蛋白所結(jié)合，并使這些DNA形成特定的染色體結(jié)構(gòu)，因?yàn)橹挥羞@樣一個(gè)前提的存在，ICP0發(fā)揮促進(jìn)相關(guān)蛋白乙?；淖饔貌啪哂猩飳W(xué)意義。而且，有資料表明，在缺少I(mǎi)CP0時(shí)，只要有其他一些病毒蛋白存在，在細(xì)胞中所引起的病毒特定基因的沉寂也可以被克服。例如，在ICP0基因缺失的情況下，以高感染復(fù)數(shù)——即以高水平的VP16也可以保證病毒基因的完整表達(dá)，此時(shí)，能夠代替ICP0作用的病毒蛋白是ICP8，這是一個(gè)在感染過(guò)程中極早期表達(dá)的、具有DNA結(jié)合能力的蛋白。因此，有關(guān)ICP0的這一可能特性，還需進(jìn)一步的研究?！緟⒁?jiàn)綠皮書(shū)】

此外，還有資料表明，ICP0能夠與干擾素調(diào)節(jié)蛋白家族中的成員IRF3和IRF7產(chǎn)生相互作用，而這一通過(guò)ICP0環(huán)指結(jié)構(gòu)域結(jié)合的作用是抑制這兩個(gè)干擾素調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)的干擾素刺激基因（ISG）的激活。我們知道，干擾素通過(guò)刺激細(xì)胞產(chǎn)生多種功能分子，是抗病毒效應(yīng)的直接直接執(zhí)行者。這些相關(guān)基因的激活抑制，顯然可以影響或降低干擾素的抗病毒功能，而ICP0的這種作用，顯然是HSV在宿主細(xì)胞增殖的重要支持。此外，也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ICP0可以和細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中的延伸因子18發(fā)生相互作用，而此作用可以改變?cè)隗w外系統(tǒng)中病毒mRNA的翻譯效率，這一結(jié)果在HSV感染細(xì)胞內(nèi)得到了證實(shí)。

總的來(lái)說(shuō)，盡管ICP0被認(rèn)為是一種病毒基因與細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄激活子，但具有多種活性，能與多種病毒蛋白、細(xì)胞蛋白結(jié)合。所以，關(guān)于ICP0的功能還需要進(jìn)一步研究。

接下來(lái)，咱們介紹一下ICP4、ICP27和ICP47。這里，咱們要說(shuō)明的是，即刻早期蛋白的主要作用是轉(zhuǎn)錄調(diào)控β基因的表達(dá)，同時(shí)影響宿主細(xì)胞蛋白的表達(dá)。

在這5個(gè)即刻早期蛋白分子中，ICP4被初步確認(rèn)為一種針對(duì)不同基因具有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的分子，對(duì)于某些HSV本身的早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程，ICP4是重要的參與因素。因此，它對(duì)病毒感染過(guò)程中病毒的生長(zhǎng)增殖是必須的。有資料表明，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，ICP4的存在的確能激活多種基因，包括病毒基因和某些細(xì)胞基因。某些體外實(shí)驗(yàn)還表明，ICP4還能夠增加其核系統(tǒng)環(huán)境中轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成的比例，這是通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的成分中TFⅡD與DNA序列上TATA元件的結(jié)合而完成的。當(dāng)然，ICP4分子內(nèi)也有DNA結(jié)合區(qū)域，但在病毒早期或晚期啟動(dòng)子中針對(duì)ICP4的特異基序至今尚未最終確定。

另外，有實(shí)驗(yàn)表明，由于即刻早期蛋白（如α-0與α-4）啟動(dòng)子與早期及晚期蛋白啟動(dòng)子中TATA元件前后的序列有所不同，因此ICP4對(duì)α-0與α-4基因的轉(zhuǎn)錄激活呈現(xiàn)抑制作用。但也有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，這是由于ICP4與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的成分TFⅡB相結(jié)合而導(dǎo)致的。盡管這些資料均未得到統(tǒng)一的結(jié)論，但是ICP4作為一種α基因的產(chǎn)物，表現(xiàn)出對(duì)早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄激活和對(duì)α基因的轉(zhuǎn)錄抑制，本身就提示α基因產(chǎn)物對(duì)β基因和γ基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。【參見(jiàn)綠皮書(shū)】目前，關(guān)于ICP4轉(zhuǎn)錄激活早期和晚期基因的機(jī)制尚未完全解釋清楚。

從結(jié)構(gòu)上看，ICP4具有幾個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中包括DNA結(jié)合區(qū)域，核定位區(qū)域和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域（TAD）。因此，ICP4在發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活作用時(shí)，可以和DNA分子、TBP和TFⅡD形成復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)表明，ICP4與TFⅡD結(jié)合的基礎(chǔ)是ICP4與TBP相關(guān)因子（TAF）的結(jié)合。當(dāng)然，這個(gè)復(fù)合物是針對(duì)病毒啟動(dòng)子的TATA元件。有實(shí)驗(yàn)對(duì)其與其他細(xì)胞分子形成復(fù)合物而結(jié)合于病毒基因啟動(dòng)子的分析表明，它需要結(jié)合并依賴多種細(xì)胞因子才能發(fā)揮其病毒基因轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。

HSV的另一個(gè)即刻早期蛋白ICP27，也對(duì)病毒早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)有重要的意義。但是，與ICP0（降解PML以釋放轉(zhuǎn)錄成分）和ICP4（雙重轉(zhuǎn)錄調(diào)控）不同，ICP27的存在主要是使病毒早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄本（mRNA水平）在感染細(xì)胞中聚集以保證病毒的復(fù)制，而將其基因敲除后的突變病毒將無(wú)法在感染細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)正常的生長(zhǎng)增殖。

ICP27也是一個(gè)多功能蛋白，而其功能實(shí)現(xiàn)則是通過(guò)它與多種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子的相互作用。例如，ICP27通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶Ⅱ全酶相互作用而實(shí)現(xiàn)對(duì)早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。而同時(shí)，ICP27又能與細(xì)胞內(nèi)RNA剪接體相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用。實(shí)驗(yàn)表明，ICP27可與pre-mRNA剪接體相關(guān)蛋白P145（SAP145）相互作用，這一作用的直接結(jié)果就是細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的pre-mRNA剪接效率受到抑制。除此之外，ICP27還能與另一個(gè)剪接相關(guān)蛋白P32相互作用。P32是一個(gè)可以通過(guò)抑制ASF/SF2剪接體與RNA的結(jié)合和磷酸化而調(diào)節(jié)RNA的剪接，它與ICP27相互作用可以影響這一調(diào)節(jié)。有實(shí)驗(yàn)表明，ICP27可以引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未剪接的細(xì)胞mRNA聚集，這一現(xiàn)象很可能與上述其與細(xì)胞RNA剪接系統(tǒng)的相互作用相關(guān)。結(jié)合ICP27對(duì)病毒早期基因和晚期基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用，這些資料顯然提示ICP27在發(fā)揮自身對(duì)病毒的功能之外，還同時(shí)通過(guò)與細(xì)胞相應(yīng)的蛋白相互作用而影響細(xì)胞RNA剪接來(lái)完成對(duì)病毒增殖的支持。

另外，還有實(shí)驗(yàn)表明，ICP27還能與細(xì)胞內(nèi)的CK2和異源性核糖核蛋白K（hnRNPK）發(fā)生相互作用。我們知道，CK2是一種多效、非特異性的蛋白激酶，在HSV感染早期，ICP27即可刺激CK2從核內(nèi)分布到細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)，CK2也能在受到ICP27刺激后使ICP27磷酸化。更為重要的是，此時(shí)的CK2還能使hnRNPK發(fā)生非正常的磷酸化，使hnRNPK的活性發(fā)生改變。而事實(shí)上，hnRNPK本身也是一個(gè)多功能蛋白，它可以在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間來(lái)回轉(zhuǎn)運(yùn)，其可能的功能是進(jìn)行pre-mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的活動(dòng)。ICP27直接和通過(guò)CK2對(duì)pre-mRNA的影響，顯然會(huì)對(duì)細(xì)胞本身的剪接系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的影響。有意思的是，實(shí)驗(yàn)還表明，ICP27還能與細(xì)胞的另一轉(zhuǎn)運(yùn)因子Aly/REF相互作用，并借此從細(xì)胞內(nèi)的剪接體募集Aly/REF，以用于將病毒的一些無(wú)內(nèi)含子的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核。同時(shí)，也有實(shí)驗(yàn)表明，ICP27還能與TAP/NXF1相互作用，這個(gè)蛋白也是將細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核的受體蛋白。這些作用之間的相互關(guān)系是一種什么樣的機(jī)制至今尚不清楚，但是討論至少提示ICP27是以一種多重方式為病毒在感染細(xì)胞過(guò)程中的復(fù)制戰(zhàn)略的某一層面——mRNA處理層面——提供系統(tǒng)支持。此外，還有實(shí)驗(yàn)表明，ICP27也可能以特定的機(jī)制發(fā)揮激活NF-kB信號(hào)途徑的作用。雖然這一功能還不清楚，但以NF-kB復(fù)雜的生理效應(yīng)，如果這一觀察被證實(shí)的話，顯然還有更多的可能性會(huì)由此產(chǎn)生。

至于HSV的另一即刻早期蛋白ICP47，則具備完全不同的功能——ICP47是調(diào)節(jié)MHCⅠ類分子表達(dá)的重要病毒蛋白。研究表明，HSV編碼的ICP47蛋白是一個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)的分子，它能阻斷細(xì)胞內(nèi)的MHCⅠ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其他細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟。該事情提示，ICP47蛋白對(duì)MHCⅠ類分子的可能靶點(diǎn)在其產(chǎn)生后開(kāi)始組裝為復(fù)合物的階段。目前的機(jī)制認(rèn)為，ICP47的作用靶點(diǎn)為T(mén)AP1/TAP2復(fù)合物。免疫沉淀和免疫熒光技術(shù)首先證明ICP47和TAP1/TAP2復(fù)合物的相互作用以及細(xì)胞內(nèi)的共定位，并進(jìn)一步證實(shí)在與ICP47結(jié)合后，TAP1/TAP2復(fù)合物失去了裝運(yùn)蛋白多肽以及結(jié)合MHCⅠ類分子的能力。其結(jié)果不僅使MHCⅠ類分子結(jié)合及呈遞抗原多肽的途徑受到阻礙，同時(shí)還能使未與抗原多頭結(jié)合的空MHCⅠ類分子迅速降解。在此過(guò)程中，可以看到ICP47的特定能力使得HSV感染所可能誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)效率明顯受到影響。盡管從系統(tǒng)的角度可以設(shè)想，ICP47的作用不可能阻斷所有關(guān)于HSV抗原的呈遞，同時(shí)，ICP47在病毒感染過(guò)程中產(chǎn)生的時(shí)間亦決定了其不可能作用于HSV感染時(shí)免疫反應(yīng)的全過(guò)程。但是，這一作用至少可以為HSV感染贏得一定的時(shí)間，使其免受免疫系統(tǒng)的攻擊，這作為HSV調(diào)控免疫細(xì)胞而保護(hù)自身生存的策略之一，顯然具有相應(yīng)的意義。【參見(jiàn)綠皮書(shū)】

最后，咱們?cè)偕晕⒖偨Y(jié)這些蛋白的功能并做些合理性地解釋。ICP0、ICP4和ICP22參與轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)控早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄水平）；ICP27主要在pre-mRNA水平上調(diào)控宿主蛋白和病毒蛋白的表達(dá)（翻譯水平）；ICP47抑制抗原肽-MHCⅠ類分子的呈遞，避免病毒入侵的細(xì)胞受到免疫系統(tǒng)的攻擊。在病毒感染細(xì)胞早期，所有即刻早期蛋白的核心任務(wù)就是為病毒的生存和增殖創(chuàng)造條件，此刻，生存大于一切。

我們可以這樣認(rèn)為，病毒感染宿主細(xì)胞后，囊膜與細(xì)胞膜融合，病毒顆粒沿微管蛋白由細(xì)胞膜移向細(xì)胞核，與此同時(shí)，含有核定位序列的皮層蛋白VP16脫落并通過(guò)某種機(jī)制入核。VP16與HCF、Oct-1形成復(fù)合物，并識(shí)別并結(jié)合通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核的病毒基因組DNA即刻早期基因啟動(dòng)子區(qū)域。隨后，5個(gè)即刻早期蛋白開(kāi)始順次表達(dá)并發(fā)揮相應(yīng)的功能。（至于命名原則，個(gè)人認(rèn)為是依據(jù)蛋白起始密碼子相對(duì)于啟動(dòng)子0的相對(duì)位置，比如α0是從啟動(dòng)子0位開(kāi)始，純屬虛構(gòu)，僅供參考）。

ICP22之所以放在最后來(lái)說(shuō)，是因?yàn)镮CP22基因還能編碼一個(gè)小一些的同源蛋白Us1.5。作為一種即刻早期蛋白，ICP22也是一個(gè)根據(jù)不同環(huán)境而表現(xiàn)不同功能的調(diào)控因子（轉(zhuǎn)錄水平）。有報(bào)道認(rèn)為，ICP22可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白cdc2以來(lái)的激酶活性而使細(xì)胞周期A和細(xì)胞周期蛋白B的降解減少而促進(jìn)HSV晚期蛋白（γ2）的表達(dá)，這似乎是一種正調(diào)控作用。而且，ICP22被Us13磷酸化后，還可以促進(jìn)晚期蛋白UL38, UL41, and Us11的表達(dá)。但也有實(shí)驗(yàn)表明，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中，ICP22可以表現(xiàn)出對(duì)多種啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，包括HSV的α、β、γ基因啟動(dòng)子和某些細(xì)胞啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄抑制作用，似乎與該蛋白和啟動(dòng)子中的共同元件TATA基序的作用有關(guān)。但是，ICP22的抑制作用在VP16的存在下可能被解除，因此提示ICP22可能與VP16一道，共同形成了病毒感染時(shí)對(duì)病毒α基因轉(zhuǎn)錄激活的正負(fù)調(diào)控機(jī)制。當(dāng)然，有關(guān)這一機(jī)制的詳細(xì)機(jī)理尚待進(jìn)一步的探索。

事實(shí)上，作為即刻早期蛋白，ICP22的關(guān)注遠(yuǎn)不如其他成員如ICP0、ICP27等。下面，結(jié)合近年的幾篇文獻(xiàn)，我們可以更深入的了解ICP22的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

Bernard等發(fā)現(xiàn)ICP22可以與細(xì)胞周期蛋白cdc9相互作用并進(jìn)一步調(diào)控晚期蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明cdc9能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄修飾后的ICP22與RNA Pol Ⅱ 相結(jié)合，并使其在轉(zhuǎn)錄復(fù)合體水平影響病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄。不過(guò)，ICP22發(fā)揮這種功能的前提條件就是ICP22要被UL13磷酸化。但是，我們不得不考慮的是，UL13是一種晚期蛋白，所以這種調(diào)控極有可能是在病毒周期晚期發(fā)揮作用。Lei Guo等人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ICP22和VP16都可以直接與轉(zhuǎn)錄延伸因子P-TEFb結(jié)合并在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合物。P-TEFb通過(guò)絲氨酸位的磷酸化RNA Pol Ⅱ以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄延伸活性，從而調(diào)控mRNA的表達(dá)。這似乎進(jìn)一步驗(yàn)證VP16和ICP22通過(guò)P-TEFb在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)α、β和γ基因的表達(dá)形成正負(fù)調(diào)控機(jī)制。當(dāng)然，這也為HSV-1感染細(xì)胞后基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的探究提供更多證據(jù)。ThomasW. Bastian等從另一角度研究ICP22的功能。實(shí)驗(yàn)表明，ICP22可以與Hsc70共定位并誘導(dǎo)VICE（病毒誘導(dǎo)伴侶蛋白富集體，包括伴侶蛋白、蛋白酶體和泛素蛋白）的產(chǎn)生，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制。不過(guò)，與ICP0缺失病毒一樣，ICP22缺失的病毒也可以在Vero細(xì)胞中生長(zhǎng)。這似乎提示，ICP22可以通過(guò)其他細(xì)胞因子來(lái)調(diào)控病毒基因的表達(dá)?？偟膩?lái)說(shuō)，ICP22也是一個(gè)參與病毒基因和宿主基因調(diào)控的多功能蛋白。它的主要作用機(jī)制似乎也是通過(guò)與宿主細(xì)胞因子相互作用，并通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。但是，作為一種即刻早期蛋白，ICP22的作用的確需要我們更多的關(guān)注。

作為ICP22（亦即Us1）的同源蛋白，Us1.5的功能也受到人們的關(guān)注。Us1.5的啟動(dòng)子和編碼區(qū)域均包含在α22中，而且大多數(shù)ICP22的功能也與Us1.5的開(kāi)放讀碼框（ORF）相關(guān)。因此，咱們?cè)谶@里不再具體介紹Us1.5的功能。

第七章：按部就班（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄相關(guān)病毒蛋白）
朋友，謝謝你能讀到這里。咱們已經(jīng)走完一半的路程了。但是，革命尚未成功，我們?nèi)孕枧?，因?yàn)榻酉聛?lái)的任務(wù)更加艱巨。

我們知道，在病毒基因組DNA進(jìn)入細(xì)胞核后，在VP16的轉(zhuǎn)錄起始作用下，5個(gè)α基因得以轉(zhuǎn)錄表達(dá)。隨著轉(zhuǎn)錄事件發(fā)生及其線性程序的進(jìn)行，25個(gè)早期蛋白（β基因）開(kāi)始表達(dá)，其中最重要的早期蛋白（E蛋白）為復(fù)制相關(guān)蛋白，它們均由位于UL區(qū)域的基因編碼，分別是：UL5、UL8、UL9、UL29、UL30、UL42、UL52。同時(shí)，一些已存在于病毒蛋白體內(nèi)的蛋白分子也將按照固定程序發(fā)揮作用，使得病毒基因DNA的復(fù)制隨之啟動(dòng)?？陀^地講，這一時(shí)段是在病毒感染細(xì)胞2~3h時(shí)，其中有些步驟在病毒基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄事件時(shí)就已同步進(jìn)行。例如，某些蛋白分子在核內(nèi)前復(fù)制位置的定位、與DNA分子的結(jié)合等。但是，嚴(yán)格地講，這一過(guò)程還是在其所需的相關(guān)病毒蛋白已準(zhǔn)備完畢的情況下，按照蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用所遵循的動(dòng)力學(xué)規(guī)則順序進(jìn)行的。此過(guò)程中，HSV按照一種與許多其他人類病毒不同，而與某些細(xì)菌病毒相似的方式操作的，它存在兩種模式，即θ復(fù)制和δ復(fù)制。這兩種復(fù)制模式的結(jié)合，最大限度地利用了病毒基因結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，使其能夠以有限的空間和時(shí)間資源，盡可能有效地復(fù)制子代病毒?！緟⒁?jiàn)綠皮書(shū)】

在詳細(xì)介紹病毒復(fù)制之前，我們有必要先了解HSV-1基因組的基本結(jié)構(gòu)。和其他皰疹病毒相同，HSV病毒基因結(jié)構(gòu)為雙股線性DNA，當(dāng)然，在病毒顆粒中，這一DNA基因組是以環(huán)形或是軸線狀被包裹在衣殼中的。此時(shí)，該DNA分子的末端常常是交疊在一起或是保持很近的距離，這種形狀的機(jī)制顯然是為了病毒顆粒在感染細(xì)胞時(shí)，一旦核衣殼結(jié)構(gòu)破壞，HSV的DNA分子即可形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)而經(jīng)核孔進(jìn)入細(xì)胞核，以便于轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。HSV病毒DNA分為長(zhǎng)片段UL (unique sequence of long component)和短片段Us (unique sequence of short component)。這兩個(gè)片段為單一序列，其兩側(cè)為重復(fù)序列，而末端的重復(fù)序列（a序列）是高度保守的，它們僅出現(xiàn)內(nèi)部重復(fù)序列數(shù)量上的變化。

實(shí)驗(yàn)表明，在病毒感染細(xì)胞半小時(shí)后，盡管細(xì)胞內(nèi)還沒(méi)有任何病毒蛋白，但病毒基因組DNA就已經(jīng)可以在細(xì)胞核內(nèi)檢出，而此時(shí)在核內(nèi)開(kāi)始積累的病毒基因DNA所呈現(xiàn)的形式是一種無(wú)游離尾端的構(gòu)型，這種構(gòu)型的基因DNA隨即形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。具體機(jī)制是HSV基因末端均具有a序列，該序列的直接重復(fù)結(jié)構(gòu)在未知原理下形成尾-尾相互連接，使整個(gè)基因分子在進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后經(jīng)過(guò)一個(gè)短暫的過(guò)程，即形成環(huán)狀的復(fù)制中間體。這種環(huán)狀DNA形式存在的基本意義，很可能是為一種已知的θ復(fù)制機(jī)制提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，盡管這一點(diǎn)在HSV還未得到直接的最終證實(shí)。

目前，對(duì)HSV病毒基因組DNA結(jié)構(gòu)的分析表明，DNA復(fù)制起始結(jié)構(gòu)含有用于DNA復(fù)制的三個(gè)順式作用元件，它們均可以作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，分別為一個(gè)OriL和兩個(gè)OriS，前者位于UL29和UL30基因之間，而后者位于內(nèi)部重復(fù)短端（IRS）和尾部重復(fù)短端（TRS）的C序列中，大致是ICP4和ICP22/47基因之間的位置。該推斷的實(shí)驗(yàn)證據(jù)是觀察到DNA復(fù)制泡首先出現(xiàn)在相應(yīng)位置，即UL區(qū)域和IRS/TRS部位，而對(duì)DNA復(fù)制的序列分析也能定位于此。另外的實(shí)驗(yàn)也表明，DNA復(fù)制最先合成的DNA序列亦是UL-Us結(jié)合部的序列。

對(duì)上述結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析表明，OriS和OriL分別含有一個(gè)45bp和144bp的回文序列，中部有一個(gè)18~20bp富含A+T的區(qū)域，而此區(qū)域的側(cè)翼是特定的重復(fù)序列，可由病毒UL9基因編碼的DNA起始結(jié)合蛋白特定識(shí)別。在OriS結(jié)構(gòu)中，一側(cè)能與該蛋白產(chǎn)生高親和性結(jié)合的區(qū)域BoxⅠ，而另一側(cè)的BoxⅡ則只能以1/10的親和力與這一蛋白結(jié)合。同時(shí)，OriL有2個(gè)BoxⅠ拷貝，而OriS只有1個(gè)。盡管BoxⅢ與BoxⅠ有很接近的結(jié)構(gòu)，但僅以一個(gè)堿基的差異，就表現(xiàn)為與DNA起始結(jié)合蛋白的低親和性。而相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表明，OriS的有效復(fù)制起始作用需要兩個(gè)DNA起始結(jié)合蛋白識(shí)別部位的完整結(jié)構(gòu)，即BoxⅠ和BoxⅡ。這樣一種結(jié)構(gòu)以及OriS和OriL都作為DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的機(jī)制尚不清楚，但根據(jù)對(duì)這兩個(gè)起始部位的分析和現(xiàn)有的DNA復(fù)制模型，可以認(rèn)為二者的存在都應(yīng)該是符合其功能需要的。Loss-of-function實(shí)驗(yàn)表明，即使將兩個(gè)OriS都去除，也不會(huì)完全影響病毒DNA的復(fù)制，這似乎提示，HSV基因DNA的復(fù)制有可能同時(shí)以θ復(fù)制和δ復(fù)制的方式進(jìn)行，而且二者都可由OriS或OriL執(zhí)行。所以，這兩個(gè)起始點(diǎn)的結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯的功能意義上的區(qū)別。

目前，關(guān)于HSV基因DNA復(fù)制的具體機(jī)制還沒(méi)有完全解釋清楚，但從許多不同的報(bào)道中，可以理出一個(gè)基本的模型和過(guò)程。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這個(gè)模式的中心環(huán)節(jié)就是，病毒基因組在借其特殊結(jié)構(gòu)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)之后，其DNA分子復(fù)制過(guò)程的起始借助于一個(gè)可在λ噬菌體中可見(jiàn)的θ模式進(jìn)行。隨后DNA分子以滾環(huán)方式不斷復(fù)制出子代的基因組DNA，其以串聯(lián)體形式產(chǎn)生，再經(jīng)酶解包裝成單個(gè)的DNA分子，這一過(guò)程涉及了多個(gè)病毒基因自身編碼的功能蛋白的相互作用。同時(shí)，病毒也可以利用宿主細(xì)胞的某些功能酶分子，如DNA聚合酶-引物酶來(lái)完成這一事件，但不依賴于這些宿主蛋白。下面我們根據(jù)現(xiàn)有的資料，大體介紹病毒的復(fù)制過(guò)程。

關(guān)于病毒DNA復(fù)制的模型，已經(jīng)肯定的是，首先應(yīng)該是UL9基因編碼的蛋白（起始結(jié)合蛋白）結(jié)合到病毒DNA具有高親和力識(shí)別的復(fù)制起始部位，即前面提到的BoxⅠ。隨后，UL9形成同源二聚體并募集其他起始結(jié)合蛋白輔助分子結(jié)合到較低親和力的識(shí)別部位，如BoxⅡ和BoxⅢ。隨后，UL9（起始結(jié)合蛋白）通過(guò)其C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步結(jié)合ICP8（UL29，單鏈DNA結(jié)合蛋白），后者可以刺激起始蛋白所具有的DNA解旋酶活性和ATP酶活性。這樣，病毒DNA雙鏈分子出現(xiàn)解旋狀態(tài)，并形成單鏈構(gòu)象以便于下一步DNA分子的復(fù)制。

隨后，UL9通過(guò)其N(xiāo)端結(jié)構(gòu)結(jié)合UL8、UL5的基因編碼產(chǎn)物（均為DNA復(fù)制蛋白亞基），并由此將引物酶活性引入復(fù)制起始復(fù)合體，但該酶并不以O(shè)riS的基本結(jié)構(gòu)作為模板，而是隨著復(fù)合體對(duì)DNA起始部位雙鏈的解旋，以起始部位旁側(cè)的序列作為模板。有資料表明，起始結(jié)合蛋白亦能以同樣的方式結(jié)合到人源細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶復(fù)合體中的α引物酶，并形成復(fù)制過(guò)程所需的起始引物以便復(fù)制鏈的延伸。這意味著HSV病毒基因的復(fù)制可以使用自身的引物酶，也能使用宿主細(xì)胞的α引物酶，這一策略顯然是十分有用的。

在DNA雙鏈解旋以及起始引物合成之后，UL9即完成了任務(wù)，并與DNA分子解離，而此時(shí)，未解旋的DNA區(qū)域仍由ICP8蛋白分子結(jié)合。隨后，ICP8通過(guò)特定方式結(jié)合HSV本身的DNA聚合聚酶體——包括UL30、UL42、UL52基因編碼的亞基部分——并促進(jìn)聚合酶發(fā)揮作用。由UL30和UL42構(gòu)成的二聚體可以催化前導(dǎo)鏈的合成，但后隨鏈的合成則是由UL30單獨(dú)地、總是低效率地完成的。

事實(shí)上，病毒基因組DNA在復(fù)制的同時(shí)，轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶（部分β基因）也開(kāi)始表達(dá)并發(fā)揮功能。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是比復(fù)制過(guò)程更為復(fù)雜的細(xì)胞活動(dòng)，具體機(jī)制也是撲朔迷離，公說(shuō)公有理，婆說(shuō)婆有理。但是，從病毒的角度看，一切的核心其實(shí)就是完成核衣殼蛋白的組裝，并包裹病毒DNA以完成其復(fù)制周期。

按照中心法則以及生化知識(shí)，我們可以知道，病毒會(huì)在轉(zhuǎn)錄（包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)控）、翻譯以及翻譯后修飾等各個(gè)水平影響調(diào)控自身蛋白的表達(dá)。咱們?cè)谇懊娼榻B的ICP0（降解PML）、VP16（轉(zhuǎn)錄起始）、ICP27（pre-mRNA剪接）都是病毒調(diào)控蛋白表達(dá)的實(shí)例。我們可會(huì)發(fā)現(xiàn)，病毒蛋白表達(dá)的調(diào)控通常是與宿主細(xì)胞因子相互作用共同完成的。下面咱們結(jié)合UL41和γ34.5對(duì)宿主翻譯系統(tǒng)的影響來(lái)具體談?wù)劜《镜鞍椎恼{(diào)控功能。

和其他人類皰疹病毒一樣，HSV感染宿主細(xì)胞過(guò)程中依次出現(xiàn)α基因、β基因和γ基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，除了α基因（即刻早期蛋白）的表達(dá)，β基因和γ基因既編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，也編碼用于病毒基因復(fù)制和細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的功能蛋白。其原因很簡(jiǎn)單，所有的病毒增殖所需的功能和結(jié)構(gòu)蛋白都需要通過(guò)細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)而產(chǎn)生。事實(shí)上，在感染宿主細(xì)胞3h內(nèi)，HSV可使宿主細(xì)胞蛋白的合成和mRNA水平下降90%。顯然，隨后的現(xiàn)象就是病毒的蛋白迅速上升呈主導(dǎo)地位。從分子生物角度講，這一過(guò)程實(shí)際上是由病毒多種蛋白執(zhí)行的多種機(jī)制所導(dǎo)致的，總體上可分為兩個(gè)階段。第一階段是宿主細(xì)胞內(nèi)原先存在的多聚核糖體迅速降解，以及一些細(xì)胞mRNA和病毒mRNA的迅速降解。這一過(guò)程發(fā)生迅速，通常在病毒感染的早期即可出現(xiàn)。而第二階段則是宿主細(xì)胞蛋白合成體系在感染的過(guò)程出現(xiàn)關(guān)閉，其出現(xiàn)的前提是某些病毒基因已經(jīng)得以表達(dá)。換句話說(shuō)，HSV感染后導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)的宿主蛋白合成是以不同時(shí)段中由不同機(jī)制引起的。

應(yīng)該說(shuō)，HSV影響宿主細(xì)胞蛋白合成的詳細(xì)機(jī)制至今還留有許多疑問(wèn)。但是，初步的分析表明，在第一階段宿主蛋白合成系統(tǒng)關(guān)閉的過(guò)程中，至少有一種病毒蛋白——病毒宿主關(guān)閉蛋白（VHS，virion hostshut-off,該蛋白由UL41基因編碼）——發(fā)揮了作用。VHS可使mRNA去穩(wěn)定，這在一定程度上導(dǎo)致了多聚核糖體的解離。我們知道，VHS是一種皮層蛋白，在病毒感染早期即可釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用。因此，其在感染的極早期發(fā)揮作用就是可以理解的了。但有關(guān)VHS降解mRNA的機(jī)制還不確定，只有一些實(shí)驗(yàn)供我們推到理解。首先，當(dāng)將來(lái)自未感染細(xì)胞的多聚核糖體和自HSV感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上清共同孵育時(shí)，可以導(dǎo)致用于實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定的mRNA分子迅速降解。其次，從HSV病毒毒粒制備的VHS蛋白粗體物或者是含有VHS的網(wǎng)狀紅細(xì)胞裂解液可以明顯的增強(qiáng)RNA酶的活性，但若是使用VHS的突變體蛋白則對(duì)RNA酶無(wú)類似影響。最后，利用抗VHS抗體可以在非細(xì)胞系統(tǒng)中抑制VHS在上述情況下所表現(xiàn)的RNA酶增強(qiáng)功能。這些證據(jù)表明，VHS蛋白的確通過(guò)增強(qiáng)RNA酶活性而降解mRNA的功能。不過(guò)，當(dāng)將純化的VHS蛋白與mRNA分子共同孵育時(shí)，則未見(jiàn)VHS對(duì)mRNA分子的降解。這提示VHS還利用了另外未知的細(xì)胞因子介導(dǎo)其對(duì)RNA酶活性的增強(qiáng)。另外，還有實(shí)驗(yàn)表明，在HSV感染細(xì)胞中，具有多聚腺苷結(jié)構(gòu)的mRNA分子比無(wú)多聚腺苷信號(hào)結(jié)構(gòu)的mRNA表現(xiàn)出更快、更明顯的降解作用。同時(shí)，去腺苷化的mRNA分子在HSV感染的細(xì)胞中可見(jiàn)明顯的聚集。這似乎提示了VHS蛋白具有針對(duì)多聚腺苷信號(hào)序列的識(shí)別結(jié)構(gòu)，但這樣的結(jié)構(gòu)在VHS中尚未確定。不過(guò)，進(jìn)一步的研究則提示，VHS似乎是通過(guò)與PABP復(fù)合物的結(jié)合而定位于poly（A）的位置。綜上所述，VHS確實(shí)可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體中的某些特定因子而發(fā)揮作用，而且執(zhí)行此功能是以自身和/或其他因子的協(xié)同作用并在一至數(shù)個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，例如poly（A）的位置，切割降解mRNA分子。有趣的是，這個(gè)位置實(shí)際上是細(xì)胞mRNA分子為了逃避宿主RNA酶的降解而具有的結(jié)構(gòu)?！緟⒁?jiàn)綠皮書(shū)】目前研究認(rèn)為，VHS是與eIF4B、eIF4H協(xié)同完成其降解功能的，eIF4F也發(fā)揮部分作用。但是其降解的mRNA序列的特列的研究尚無(wú)進(jìn)展。

除了VHS的研究，另一焦點(diǎn)就是病毒蛋白γ34.5。（VHS在mRNA 水平，而γ34.5在翻譯后修飾水平發(fā)揮作用）。通常在一些病毒感染的細(xì)胞中，病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的一些高度結(jié)構(gòu)化的雙鏈RNA（dsRNA）可以結(jié)合并激活宿主細(xì)胞內(nèi)的PKR（蛋白激酶R），后者隨之使eIF2α分子磷酸化，這導(dǎo)致的直接結(jié)果就是細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)喪失其功能活性。同時(shí)，病毒的蛋白合成及復(fù)制也將在感染細(xì)胞中受到抑制。有實(shí)驗(yàn)表明，在缺失γ34.5基因的HSV的感染中，這些病毒不能在人類的一些惡性腫瘤組織生長(zhǎng)，而同時(shí)這些細(xì)胞表現(xiàn)出較高的PKR表達(dá)和活性，也可見(jiàn)到其eIF2α的磷酸化極為明顯，使得病毒感染的細(xì)胞過(guò)早出現(xiàn)蛋白合成的關(guān)閉，而導(dǎo)致病毒的生長(zhǎng)受到阻滯，而且這一過(guò)程不是由VHS的蛋白合成關(guān)閉功能和mRNA 降解引起的。

事實(shí)上，隨后實(shí)驗(yàn)亦表明γ34.5基因編碼產(chǎn)物確實(shí)以不同的作用模式參與上述事件。例如，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明，γ34.5基因編碼產(chǎn)物能夠和細(xì)胞蛋白磷酸酶1α（PP1α）發(fā)生相互作用，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，它們可以形成復(fù)合物，而且含有這種復(fù)合物的組分可以使純化的eIF2α分子發(fā)生去磷酸化作用。換句話說(shuō)，γ34.5基因產(chǎn)物可以作為PP1α的調(diào)節(jié)子或是復(fù)合物的靶向性亞單位是其將eIF2α分子去磷酸化以中和PKR的活性。但此過(guò)程的具體機(jī)理還不清楚，因?yàn)檫€沒(méi)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)γ34.5基因產(chǎn)物和PP1α之間具有直接的相互作用。不過(guò)，有實(shí)驗(yàn)提示，PP1α可以直接結(jié)合eIF2α并使其磷酸化，但是這種現(xiàn)象是否能在HSV感染的細(xì)胞中出現(xiàn)還不清楚。同時(shí)，還有實(shí)驗(yàn)表明，病毒蛋白Us11編碼產(chǎn)物能夠補(bǔ)償γ34.5的功能。Us11可以與RNA結(jié)合并與核糖體相關(guān)聯(lián)，從而降低PKR的活性。

綜合這些自資料，我們可以看到，HSV至少編碼兩種蛋白——Us1 和γ34.5，通過(guò)靶向結(jié)合細(xì)胞的PKR和eIF2α來(lái)影響調(diào)控細(xì)胞的翻譯機(jī)器，而這兩種蛋白的作用顯然是相互協(xié)調(diào)和互補(bǔ)的。γ34.5基因產(chǎn)物中包含一個(gè)與細(xì)胞蛋白GADD34分子具有典型同源結(jié)構(gòu)的區(qū)域，而GADD是細(xì)胞在受到一些終止生長(zhǎng)、DNA損壞和特定分化信號(hào)刺激時(shí)所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)。而且，它可以和PP1α發(fā)生相互作用，并在γ34.5基因缺失的突變體病毒感染細(xì)胞中替代γ34.5基因產(chǎn)物的功能，以延長(zhǎng)晚期蛋白合成。當(dāng)然，其他病毒蛋白，尤其是皮層蛋白是否也在病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用還需要進(jìn)一步探索。

第八章 建筑高手（衣殼形成和DNA組裝）

對(duì)于病毒來(lái)說(shuō)，接下來(lái)的事情就順理成章了——組裝核衣殼體和裝配DNA。前面咱們已經(jīng)介紹核衣殼的組成和結(jié)構(gòu)，下面咱們主要介紹核衣殼體的裝配過(guò)程。

研究HSV-1感染的細(xì)胞中核衣殼體蛋白的相互作用并由此形成核衣殼體基本結(jié)構(gòu)的過(guò)程是非常困難的，因?yàn)榇罅考?xì)胞蛋白和病毒蛋白的存在使許多敏感精細(xì)的技術(shù)無(wú)法確定這些結(jié)構(gòu)蛋白之間的關(guān)系。目前，根據(jù)蛋白質(zhì)相互作用的基本動(dòng)力學(xué)原理，一種體外蛋白相互作用分析系統(tǒng)的技術(shù)得到了應(yīng)用。

在此體系中，利用表達(dá)純化的方法得到相關(guān)病毒蛋白以期認(rèn)識(shí)它們之間的關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VP23和VP19c具有明顯的相互作用的特性，這種特性使得兩個(gè)VP23趨于形成同源二聚體，而此同源二聚體又能夠與一個(gè)VP19c分子形成異源三聚體。這個(gè)三聚體在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為類三角棱體，是HSV-1核衣殼微粒結(jié)構(gòu)中的重要連接結(jié)構(gòu)。利用突變分析表明，在此三聯(lián)體結(jié)構(gòu)中，VP19c的C端15個(gè)氨基酸與整個(gè)三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)活性直接相關(guān)。去掉這15個(gè)氨基酸的VP19c仍然能夠與VP23反應(yīng)，但是該三聯(lián)體將不能作為核衣殼體的結(jié)構(gòu)單位實(shí)施功能。由此可以認(rèn)為，VP19c的C端可能是與主要的衣殼蛋白VP5相互作用的部位。與此相反的是，VP19c的N端則與三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)活性無(wú)關(guān)，當(dāng)去除N端的90個(gè)氨基酸時(shí)，該三聯(lián)體仍然形成最終的前殼體結(jié)構(gòu)，但是當(dāng)去除N端的105個(gè)氨基酸時(shí)，該三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)活性明顯丟失。這提示，在N端90-105位的氨基酸中存在一個(gè)與其他蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。對(duì)VP23的突變分析也表明，VP23的C端與三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)活性直接相關(guān)，去除其C端10個(gè)氨基酸，即可使其結(jié)構(gòu)活性喪失；而在去除N端71個(gè)氨基酸時(shí)，才可看到其對(duì)三聯(lián)體結(jié)構(gòu)活性的影響。

在研究三聯(lián)體結(jié)構(gòu)形成的同時(shí)，主要?dú)んw蛋白VP5與折疊蛋白pre-VP22a的相互關(guān)系以及二者與三聯(lián)體蛋白的關(guān)系也得以認(rèn)識(shí)。體外蛋白裝配體系和相關(guān)方法，如密度梯度離心等，均提示VP5可以先和pre-VP22a相互作用。這一相互作用依賴于VP5與pre-VP22aC端25 個(gè)氨基酸所形成特定結(jié)構(gòu)的接觸，從而形成一個(gè)VP5和pre22a復(fù)合體；而隨著這個(gè)結(jié)合，pre-VP22a折疊結(jié)構(gòu)舒展開(kāi)來(lái)并以一個(gè)機(jī)理未知的動(dòng)力學(xué)過(guò)程將上述25個(gè)氨基酸切下。此時(shí)，VP5和pre-VP22a形成的復(fù)合物將作為衣殼微粒的主要結(jié)構(gòu)，但是，該復(fù)合物還需與VP19c-VP23三聯(lián)體復(fù)合物結(jié)合，形成一個(gè)半弧狀的結(jié)構(gòu)體，通常稱作核衣殼體部分結(jié)構(gòu)單位（partial capsid），多個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步聚合形成核衣殼前體（procapsid）。之后，核衣殼前體結(jié)構(gòu)中的pre-VP22a經(jīng)病毒絲氨酸蛋白酶的酶解清除，則該核衣殼前體進(jìn)一步成熟為核衣殼體。這一過(guò)程在病毒感染的細(xì)胞中基本得到了證實(shí)，而且，細(xì)胞內(nèi)的熒光定位分析進(jìn)一步確認(rèn)，VP5與pre-VP22a的相互作用以及VP19c與VP23形成三聯(lián)體的過(guò)程均發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中。之后，兩個(gè)復(fù)合物蛋白轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，在核內(nèi)聚集形成核衣殼部分結(jié)構(gòu)單位和核衣殼前體。

事實(shí)上，在病毒核衣殼形成之后，病毒接下來(lái)的最重要事件就是基因DNA在特定的機(jī)制下裝配進(jìn)入核衣殼。在HSV-1病毒中，它至少涉及7個(gè)基因編碼蛋白，分別由UL6、UL15、UL25、UL28、UL32、UL33以及UL17基因編碼。此外，UL12基因編碼的蛋白亦發(fā)揮一定的作用，盡管不是絕對(duì)必需的，但是這個(gè)蛋白的缺失可使病毒的產(chǎn)量降低100~1000倍。分子生物學(xué)的分析表明，UL12基因編碼的蛋白屬于堿性磷酸酶，雖然其不直接在病毒基因DNA的包裝中發(fā)揮，但也（間接）參與了DNA的包裝過(guò)程。

另外，其他幾個(gè)蛋白均直接參與DNA的酶切與包裝作用。例如，突變體實(shí)驗(yàn)表明，UL25編碼蛋白的作用似乎是將病毒基因組DNA固定于核衣殼體內(nèi)，其他幾個(gè)蛋白則同時(shí)作為核衣殼體的結(jié)構(gòu)成分，同時(shí)也作為DNA的包裝功能發(fā)揮作用。但它們?cè)诓煌问降暮艘職んw中的存在又有所不同，如UL6、UL17、UL15和UL25這4個(gè)基因編碼蛋白都可以在A、B、C三種核衣殼形式以及成熟核衣殼體中存在。這似乎意味著它們?cè)谧鳛楹艘職そY(jié)構(gòu)成分的同時(shí)也發(fā)揮DNA包裝及酶切的功能。更有意思的是，UL17基因編碼產(chǎn)物對(duì)于病毒基因組DNA進(jìn)入核衣殼前體是不可缺少的結(jié)構(gòu)，因此，它也同時(shí)存在于三種形式的核衣殼以及成熟的病毒顆粒中。這些現(xiàn)象表明，它既是一種次要的核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，也以病毒的皮層蛋白形式存在，而且它在成熟病毒顆粒中的數(shù)量大約是C型核衣殼形式中的兩倍。UL6編碼的蛋白也是一種次要的核衣殼蛋白，不過(guò)，它在DNA包裝過(guò)程中可以形成核衣殼結(jié)構(gòu)上的DNA入口（Portal）。從核衣殼的結(jié)構(gòu)看，每一個(gè)形成的核衣殼均具有一個(gè)環(huán)指形式的入口。該入口位于核衣殼體的軸線上，是12個(gè)垂直面上的一個(gè)中心位置結(jié)構(gòu)，由12個(gè)UL6基因編碼蛋白組成。其組裝過(guò)程的啟動(dòng)（initiation step）其實(shí)是在部分核衣殼體形成過(guò)程中開(kāi)始的，并隨著核衣殼前體的形成而組裝進(jìn)入核衣殼結(jié)構(gòu)的特定位置。

第九章：完美綻放（病毒出核膜和釋放）

核衣殼在細(xì)胞核內(nèi)裝配完成后，病毒首先要從細(xì)胞核逸出至細(xì)胞質(zhì)。在這個(gè)過(guò)程中，它要穿過(guò)核膜并經(jīng)歷第一次外膜包裹。當(dāng)?shù)竭_(dá)細(xì)胞質(zhì)后，病毒需要去除第一次包裹形成的外膜，并完成皮層蛋白層化（tegumentation），使得核衣殼外形成一層皮層蛋白。然后，病毒再次穿越細(xì)胞質(zhì)膜，并經(jīng)歷第二次外膜包裹而逸出細(xì)胞，從而形成最終的成熟病毒顆粒。病毒的裝配與逸出過(guò)程是我們認(rèn)識(shí)和理解病毒復(fù)制周期以及基因功能的重要環(huán)節(jié)。

當(dāng)皰疹病毒經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制以及DNA在核衣殼的組裝而形成完整的核衣殼體后，該核衣殼體在細(xì)胞核膜的內(nèi)膜上形成出芽狀態(tài)。在這個(gè)出芽過(guò)程中，核衣殼體就可以獲得來(lái)自于細(xì)胞核膜的內(nèi)膜葉。這一過(guò)程在HSV-1感染細(xì)胞中已得到詳細(xì)的分析，而且，其動(dòng)態(tài)過(guò)程也得到了細(xì)致的資料。

實(shí)驗(yàn)表明，HSV-1核衣殼體在細(xì)胞內(nèi)膜上出芽并獲得第一次的囊膜而進(jìn)入核周間隙中。事實(shí)上，這一過(guò)程不是簡(jiǎn)單的核衣殼體跨膜運(yùn)動(dòng)，有兩個(gè)病毒蛋白，即UL31和UL34基因編碼產(chǎn)物參與了該過(guò)程。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，UL34蛋白是一個(gè)Ⅱ型囊膜錨定蛋白，在表達(dá)后存在于感染細(xì)胞的核膜間隙中；而UL31蛋白則是核磷酸化蛋白，位于感染細(xì)胞的核膜上。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明二者具有物理意義上的相互結(jié)合，因此它們可能是以一種相互結(jié)合的形式?jīng)Q定它們?cè)谀ど系姆€(wěn)定性。突變分析表明，二者之中缺乏任何一個(gè)后，核衣殼體逸出核膜的過(guò)程都會(huì)失敗。在HSV-1感染細(xì)胞中觀察到，核衣殼體在逸出核膜過(guò)程中可導(dǎo)致該核膜相鄰層狀體的部分損壞。這很明顯地提示，UL34蛋白可通過(guò)破壞核膜層狀體結(jié)構(gòu)而為病毒核衣殼體逸出細(xì)胞膜提供先決條件。病毒結(jié)構(gòu)的分析表明，逸出核膜、經(jīng)過(guò)第一次囊膜包裹的病毒毒粒表面確實(shí)存在UL31和UL34蛋白，但成熟的病毒顆粒上則不含有這兩個(gè)蛋白分子。因此，有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，UL34蛋白屬于病毒核衣殼體第一次囊膜上的蛋白，而UL31蛋白則可能屬于病毒成熟過(guò)程中第一次裝配的皮層蛋白。從這個(gè)意義看，這兩個(gè)蛋白確實(shí)可能在核衣殼體逸出核膜過(guò)程中以相互作用的方式參與這一過(guò)程。這一過(guò)程是否涉及其他膜蛋白或皮層蛋白尚不清楚，但可以肯定的是，成熟病毒顆粒囊膜表面存在的糖蛋白，如gB、gC等肯定不參與這一過(guò)程。

在上述過(guò)程結(jié)束后，隨后的事件就有一些細(xì)節(jié)不太確定了。最近，免疫電鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，核周間隙的病毒顆粒與成熟病毒顆粒在結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)為，核周間隙的病毒顆粒具有UL31和UL34蛋白，而存在于胞質(zhì)或是胞外的病毒顆粒則已不具有這兩種蛋白。但是，核周間隙的病毒顆粒所不具有的兩個(gè)主要皮層蛋白（UL49和UL46基因編碼）則明顯存在于胞外或是胞質(zhì)的病毒顆粒中。不過(guò)，盡管如此，在這一模型中，核周間隙與核外膜層狀物融合的具體分子機(jī)制仍不清楚?！緟⒁?jiàn)綠皮書(shū)】

事實(shí)上，病毒釋放的過(guò)程也是極為復(fù)雜的，皮層蛋白和囊膜蛋白在其中都有什么樣的作用呢？我們知道，跟許多其他DNA或RNA病毒明顯不同的是，HSV-1等皰疹病毒具有相當(dāng)數(shù)量的皮層蛋白。那么這些蛋白除了結(jié)構(gòu)上的意義之外，是否還有非結(jié)構(gòu)的功能呢？

最近的實(shí)驗(yàn)表明，這些皮層蛋白之所以被認(rèn)為是執(zhí)行基質(zhì)蛋白的功能，是因?yàn)樗鼈兗瓤梢耘c病毒的核衣殼體結(jié)構(gòu)結(jié)合，又可與病毒囊膜的糖蛋白的內(nèi)部尾端相結(jié)合，使得它們成為病毒顆粒完整結(jié)構(gòu)的中間部分。盡管如此，長(zhǎng)期以來(lái)，人們都傾向于把皮層蛋白看做是非結(jié)構(gòu)蛋白。隨著低溫電鏡分析的深入，人們發(fā)現(xiàn)至少在HSV-1的結(jié)構(gòu)中，皮層蛋白靠近核衣殼體的最深層部位，也同樣呈現(xiàn)出二十面體對(duì)稱形狀。而形成這樣一個(gè)結(jié)構(gòu)的原因，是由于一個(gè)最大的、約含2000個(gè)氨基酸的皮層蛋白——UL36基因編碼蛋白——能夠與核衣殼體直接作用而形成結(jié)合體。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)分析表明，UL36蛋白確實(shí)可以與核衣殼蛋白UL19蛋白相互作用而結(jié)合，這使得圍繞核衣殼體的第一層皮層蛋白（即UL36蛋白）在形狀上呈現(xiàn)出二十面體的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，如果在病毒中利用突變技術(shù)敲除另一皮層蛋白UL37基因，則病毒核衣殼體就會(huì)停留聚集于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而不會(huì)形成成熟顆粒。這些聚集的核衣殼體不會(huì)發(fā)生直接的相互作用，但是可以以突出的蛋白膜狀結(jié)構(gòu)相互接觸。有學(xué)者認(rèn)為，這種膜狀物的結(jié)合，實(shí)際上就是由UL36蛋白介導(dǎo)的。在UL37基因突變的情況下，它們因?yàn)槭ゾ植课恢玫南拗贫霈F(xiàn)變構(gòu)。由此推斷，固定UL36蛋白以保持其特定二十面體結(jié)構(gòu)的就是UL37蛋白。因此，可以認(rèn)為，皮層蛋白的第二層就是UL37蛋白。有意思的是，UL36和UL37蛋白差不多在所有人類皰疹病毒中都具有明顯的保守性。

但是，一些病毒形態(tài)學(xué)的初步分析似乎提示，某些皮層蛋白的缺失，好像并不具有特別重要的意義。例如，UL13、Us3、UL41、UL46、UL47、UL49基因的缺失似乎并不影響病毒成熟顆粒的形成。但是，當(dāng)敲除UL48（即VP16）基因時(shí)，病毒顆粒在細(xì)胞質(zhì)的成熟受到明顯干擾，這表明VP16 是皮層蛋白層中的重要成分。進(jìn)一步的分析表明，VP16可以和其他皮層蛋白，如UL49（VP22蛋白）相互作用。另外，還可以與UL41（VHS蛋白）相互作用，而此作用對(duì)病毒的發(fā)育成熟有明顯的影響，因?yàn)閷?duì)VHS基因缺失的突變分析表明，當(dāng)VHS基因突變足以影響其與VP16的結(jié)合時(shí)，VHS就無(wú)法被裝配進(jìn)入HSV-1毒粒之中，而完整的病毒顆粒就難以形成。另外，VP16還能夠和UL46、UL47編碼的VP11/12、VP13/14以及糖蛋白具有相互作用。雖然這些作用的機(jī)理及直接結(jié)果尚不明確，但至少可以提示，VP16對(duì)病毒間質(zhì)化的過(guò)程和布局具有十分重要的作用。這樣一個(gè)在病毒結(jié)構(gòu)和成熟裝配中具有重要意義，又在病毒基因轉(zhuǎn)錄激活中具有重要作用的雙層功能蛋白，確實(shí)具有很大的研究?jī)r(jià)值。根據(jù)現(xiàn)有資料，目前皮層蛋白包括，UL4、UL11、UL13、UL14、UL21、UL36、UL37、UL41、UL46、UL48、UL49、UL51、UL56、ICP0、ICP4、Us3、Us10、Us11。我們看到，這些蛋白均大多具有非結(jié)構(gòu)功能，因此，我們可以推斷，皮層蛋白的功能還很值得我們?nèi)ヌ骄俊?/p>

但是，在整個(gè)釋放過(guò)程中，囊膜蛋白才是真正的主角。根據(jù)現(xiàn)有資料，囊膜蛋白包括UL1、UL10、UL20、UL22、UL27、UL43、UL44、UL45、UL49.5、UL53、Us5、Us6、Us7、Us8和Us9等，這些蛋白在病毒入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中扮演重要的角色。接下來(lái)，我們介紹這些囊膜蛋白的形成。

在病毒完成間質(zhì)化之后，其成熟過(guò)程的下一步就是第二次囊膜裝配。從形態(tài)學(xué)上看，這次囊膜蛋白的裝配是由處于細(xì)胞質(zhì)的核衣殼體經(jīng)過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中的囊泡膜上的芽生過(guò)程而形成一個(gè)完整的病毒顆粒。而后，包裹這個(gè)病毒顆粒的囊泡再與細(xì)胞質(zhì)膜融合，將包含在其中的成熟病毒顆粒釋放出細(xì)胞。

盡管形態(tài)學(xué)分析已經(jīng)清晰地揭示HSV-1病毒成熟的第二次囊膜裝配過(guò)程，但有關(guān)這一生物學(xué)事件的分子機(jī)理仍不清楚。不過(guò)，一些關(guān)于HSV-1病毒囊膜糖蛋白的突變分析提示，這次囊膜裝配的過(guò)程似乎與這些囊膜糖蛋白相關(guān)。就一般的遺傳學(xué)意義上看，位于囊膜的HSV-1編碼糖蛋白對(duì)病毒的復(fù)制與增殖似乎無(wú)直接的必要聯(lián)系，但當(dāng)病毒缺失糖蛋白gE、gI和gM時(shí)，則病毒在敏感細(xì)胞中的噬斑形成將受到明顯抑制。因此，gE、gI和gM對(duì)病毒的第二次囊膜裝配具有非常重要的作用。而且，發(fā)揮這一作用的可能就是這些糖蛋白的尾部，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)表明，當(dāng)在上述突變體中的糖蛋白gD的跨膜區(qū)融合入gE的尾部時(shí)，則能夠在一定程度上改變上述突變體的表型。此外，在在第二次囊膜裝配的過(guò)程中，病毒囊膜糖蛋白在囊泡上的排列具有嚴(yán)格的方向性以確保糖蛋白的尾部均與間質(zhì)化的核衣殼體結(jié)合。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)確證，糖蛋白，如gE蛋白、gM蛋白的尾部與UL49蛋白有特異的相互作用。從這個(gè)意義上看，UL49蛋白也應(yīng)該在病毒的第二次囊膜裝配過(guò)程中具有重要的意義。但有意思的是，在一些皰疹病毒增殖及毒粒形成過(guò)程中，如UL49蛋白并非絕對(duì)需要。但在VZV中，該產(chǎn)物又是十分重要的；同時(shí)，HSV-1的gE和gI基因的缺失則會(huì)使細(xì)胞的裝配受阻。從這些資料看，我們可以初步明確的是，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核衣殼體與UL36蛋白之間的相互作用，以及UL49蛋白與gE、gI和gM之間的相互作用。

當(dāng)然，也許其他未知蛋白之間的相互作用，是促進(jìn)病毒第二次囊膜裝配的主動(dòng)原因。有實(shí)驗(yàn)觀察很清楚地證明，在去除了UL37基因的病毒感染的細(xì)胞中，金標(biāo)抗體檢測(cè)證實(shí)UL49蛋白細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的質(zhì)膜上，而囊膜在聚集的核衣殼體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。還有實(shí)驗(yàn)表明，gE蛋白，尤其是gE的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域與HSV-1在組織培養(yǎng)中的極性細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞之間的傳遞過(guò)程有明顯關(guān)系。這可能是由于gE/gI復(fù)合物通常結(jié)合于細(xì)胞-細(xì)胞之間的結(jié)合部所致。當(dāng)然，有推論認(rèn)為，這可能是gE/gI引導(dǎo)間質(zhì)化的核衣殼體通過(guò)特定囊泡膜部位形成出芽的原因?？偟膩?lái)說(shuō)，在已間質(zhì)化的核衣殼體進(jìn)行第二次囊膜裝配的過(guò)程中，還有許多未知的機(jī)理有待于了解。但是，大體過(guò)程我們是可以知道的。

第十章：病毒復(fù)制的整個(gè)周期

HSV在進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中，通過(guò)膜蛋白和多個(gè)細(xì)胞受體、輔助受體的結(jié)合以完成其介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合并使病毒進(jìn)入細(xì)胞的任務(wù)。現(xiàn)有模型認(rèn)為，HSV在吸附細(xì)胞膜表面時(shí)，先是糖蛋白gC和/或gB與細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）非特異性結(jié)合，這種結(jié)合使得病毒囊膜與細(xì)胞膜的空間距離縮短。隨后，gD與胞膜上的特異性受體結(jié)合，后者可能為HVEM（herpes virusentry mediator，腫瘤壞死因子家族成員），或是nectin-1和nectin2（免疫球蛋白超家族成員），還可能是由3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶催化硫酸肝素黏分子而產(chǎn)生的異構(gòu)體（3-OST-3）。這些結(jié)合進(jìn)一步啟動(dòng)gH、gL，可能還有g(shù)K等，與上述蛋白一起，發(fā)揮促進(jìn)介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合的作用。

進(jìn)入細(xì)胞后，HSV-1在細(xì)胞內(nèi)向核區(qū)域移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程與微管系統(tǒng)密切相關(guān)。首先，進(jìn)入細(xì)胞的HSV-1核衣殼與微管的相關(guān)動(dòng)力蛋白相結(jié)合；隨后，即循微管網(wǎng)絡(luò)移向細(xì)胞核；在到達(dá)核膜時(shí)，HSV-1核衣殼則似乎是將所含有的基因組DNA注入細(xì)胞核內(nèi)。

病毒基因組入核后，基因組DNA靶向定位于PML小體。事實(shí)上，PML小體具有抗病毒作用，然而病毒的皮層蛋白ICP0 具有E3泛素酶作用，可以破壞PML的結(jié)構(gòu)，釋放出病毒可以用于復(fù)制的細(xì)胞因子（不清楚具體因子是什么）。實(shí)驗(yàn)證明，感染細(xì)胞的病毒線性DNA很快形成環(huán)狀的復(fù)制中間體。隨后，病毒有可能同時(shí)以δ復(fù)制和θ復(fù)制的方式開(kāi)始DNA復(fù)制過(guò)程（具體的復(fù)制過(guò)程咱們后面會(huì)說(shuō)），從而完成病毒基因組DNA的復(fù)制。

當(dāng)病毒基因DNA分子進(jìn)入細(xì)胞核后，將出現(xiàn)一個(gè)由宿主細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體介導(dǎo)，并由病毒皮層蛋白VP16啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)事件。這一事件涉一些胞內(nèi)蛋白分子，如Oct-1、HCF等，這些細(xì)胞蛋白與病毒蛋白形成的聚合體多蛋白復(fù)合物，將結(jié)合至皰疹病毒基因組中α基因的啟動(dòng)子區(qū)域，以順式激活的方式啟動(dòng)5個(gè)α基因產(chǎn)物（以HSV-1為例），即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)病毒基因組線性轉(zhuǎn)錄過(guò)程。隨后，β基因產(chǎn)物開(kāi)始產(chǎn)生（病毒DNA復(fù)制相關(guān)酶均為β基因產(chǎn)物），病毒基因DNA分子也開(kāi)始復(fù)制。當(dāng)γ基因產(chǎn)物（多為結(jié)構(gòu)蛋白）也順序被轉(zhuǎn)錄并翻譯形成后，復(fù)制完整的基因分子即可作為子代病毒的基因組用于新病毒的裝配合成了。

首先合成的ICP0分子通常出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)或核結(jié)構(gòu)附近的位置，這些位置相對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)點(diǎn)就是ND10。其主要組成成分即為早幼粒細(xì)胞白血病蛋白體（PML），而PML又可結(jié)合其他在染色體構(gòu)象調(diào)控（如組蛋白乙?；⑷ヒ阴；┲衅鹱饔玫牡鞍?，如Daxx、CBP、sp100等。這些蛋白在與PML結(jié)合的過(guò)程中可以呈現(xiàn)天然構(gòu)象或是小分子泛素化修飾的狀態(tài)。很明顯，ICP0在這些部位的聚集及與相關(guān)分子的相互作用，提示其可能影響細(xì)胞內(nèi)某些與染色體基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的調(diào)控因子。隨著感染細(xì)胞內(nèi)ICP0量的增加，其可逐漸在細(xì)胞核內(nèi)彌散并充滿整個(gè)細(xì)胞核。感染后期，尤其是病毒基因組DNA合成已經(jīng)完畢后，該蛋白則可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)檢出，這一現(xiàn)象事實(shí)上是ICP0通過(guò)某種尚未確定的機(jī)制（可能是與細(xì)胞周期蛋白D3）由細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)致的。還有報(bào)道認(rèn)為，ICP0從細(xì)胞核移向細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)散過(guò)程中，同時(shí)促進(jìn)了ND10結(jié)構(gòu)的解聚及其組分，如PML、sp100等的降解。（有利于病毒復(fù)制）

在ICP0發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用的同時(shí)，ICP4對(duì)α-0與α-4基因的轉(zhuǎn)錄激活則呈現(xiàn)抑制作用。也有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，這是由于ICP4與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的成分TFⅡB結(jié)合而導(dǎo)致的。盡管這些資料均未得到統(tǒng)一的結(jié)論，但是ICP4作為一種α基因的產(chǎn)物，表現(xiàn)出對(duì)早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄激活和對(duì)α基因的轉(zhuǎn)錄抑制，本身就提示α基因產(chǎn)物對(duì)β基因和γ基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。

與ICP0（降解PML以釋放轉(zhuǎn)錄成分）和ICP4（雙重轉(zhuǎn)錄調(diào)控）不同，HSV-1的ICP27的存在主要是使病毒早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄本（mRNA水平）在感染細(xì)胞中聚集以保證病毒的復(fù)制，而將其基因敲除后的突變病毒將無(wú)法在感染細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)正常的生長(zhǎng)增殖。

HSV編碼的ICP47蛋白位于細(xì)胞質(zhì)，它能阻斷細(xì)胞內(nèi)的MHCⅠ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其他細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟。目前機(jī)制認(rèn)為，ICP47作用靶點(diǎn)為T(mén)AP1/TAP2復(fù)合物。在與ICP47結(jié)合后，TAP1/TAP2復(fù)合物失去裝運(yùn)蛋白多肽以及結(jié)合MHCⅠ類分子的能力。其結(jié)果不僅使MHCⅠ類分子結(jié)合及呈遞抗原多肽的途徑受到阻礙，同時(shí)還能使未與抗原多頭結(jié)合的空MHCⅠ類分子迅速降解。在此過(guò)程中，可以看到ICP47的特定能力使得HSV感染所可能誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)效率明顯受到影響。這一作用為HSV-1感染贏得一定的時(shí)間，使其免受免疫系統(tǒng)的攻擊。

作為即刻早期蛋白，ICP22也是一個(gè)根據(jù)不同環(huán)境而表現(xiàn)不同功能的調(diào)控因子（轉(zhuǎn)錄水平）。有報(bào)道認(rèn)為，ICP22可以促進(jìn)HSV晚期蛋白（γ2）的表達(dá)，這似乎是一種正調(diào)控作用。但也有實(shí)驗(yàn)表明，ICP22可以表現(xiàn)出對(duì)多種啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，包括HSV的α、β、γ基因啟動(dòng)子和某些細(xì)胞啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄抑制作用。但是，ICP22的抑制...