動物行為實驗指南丨嚙齒動物口面部疼痛評估方法總結

口面部疼痛評估裝置（OPAD）是一種基于自愿行為的操作性疼痛評估系統。OPAD系統由一個熱刺激器和金屬絲組成，可用于評估熱敏感性和機械敏感性。處于饑餓狀態的實驗對象被放置在操作箱內，只有當它接觸熱刺激和機械刺激時，才能獲取食物獎勵。從本質上講，實驗對象需要選擇忍受刺激以獲得獎勵。與傳統的通常基于反射行為的檢測不同，OPAD允許實驗對象為獲得獎勵自行選擇刺激閾值。這種獎勵-沖突范式在表面效度、內容效度和預測效度方面表現更佳。最初的操作性疼痛評估裝置僅設計用于評估熱敏感性。該裝置包括一對熱刺激器，它們由接地的鋁管構成，排列在通往獎勵喂食器的開口處。通過柔性聚乙烯管將加熱或冷卻到所需刺激溫度的水輸送過來，從而誘導熱刺激。

基本組成和原理：

OPAD裝置的熱刺激器主要由能夠產生和調節熱量的部件構成。其工作原理是基于熱傳導，通過特定的加熱元件（如加熱絲等）將電能轉化為熱能。當開啟熱刺激功能時，加熱元件會升溫，熱量會傳遞到與動物（如實驗大鼠等）接觸的部分。

熱刺激器通常可以精確控制溫度的變化，這是因為它配備了溫度傳感器和反饋調節系統。溫度傳感器能夠實時監測熱刺激器表面的溫度，然后將溫度信號反饋給控制器。控制器根據預設的溫度程序和反饋的溫度信息，調整加熱元件的功率，以確保溫度保持在設定的范圍內。例如，如果預設溫度為40℃，當溫度傳感器檢測到溫度低于40℃時，控制器會增加加熱元件的功率，使溫度上升；當溫度高于40℃時，則會降低功率，使溫度下降。

儀器與設備：

OPAD由一個帶有金屬底座的透明丙烯酸籠子組成。籠子底部有一個額外的金屬格柵。在籠子的一側，通往獎勵喂食器的開口處排列著一對熱刺激器和鎳鈦合金絲，分別對口面部區域提供熱刺激和機械刺激。熱刺激器之間的距離可以改變，以適應動物的大小。此外，溫度（4°C至75°C的溫度范圍）和裝置的實驗參數可以使用相關軟件和液晶顯示屏進行控制和管理。該儀器配備了一個帶有金屬噴嘴的獎勵瓶。只有同時接觸熱刺激器或機械突出物才能獲得獎勵。該設備允許自動記錄數據。

實驗中的應用方式：

在使用OPAD進行實驗時，熱刺激器會與動物的口面部等部位接觸。動物被放置在操作箱內，由于饑餓驅動它去獲取食物獎勵。為了得到獎勵，動物需要接觸熱刺激。熱刺激器的溫度可以根據實驗目的進行調整。例如，在研究不同程度熱刺激引起的疼痛反應時，可以設置一系列不同的溫度梯度，如從35℃（接近正常體溫，作為對照溫度）逐步升高到50℃。當熱刺激器溫度升高時，動物接觸熱刺激所感受到的疼痛程度可能會相應增加。動物會根據自身對疼痛的耐受程度來選擇是否繼續接觸熱刺激以獲取食物獎勵。這種自主選擇行為能夠幫助研究人員了解動物對熱刺激疼痛的感知和反應閾值。

實驗過程中，熱刺激器的工作時間也可以進行控制。可以設置單次熱刺激的持續時間，比如每次熱刺激持續5秒，然后間隔一段時間（如10秒）后再次進行熱刺激。通過觀察動物在不同熱刺激時間下的反應，研究人員可以進一步分析動物對熱刺激疼痛的時間-反應關系。例如，隨著熱刺激時間的延長，動物可能會更快地停止接觸熱刺激以避免疼痛。

研究表明，在42°C和45°C時，能夠觀察到辣椒素誘導的顯著的異常性疼痛和痛覺過敏效應。另一項研究使用OPAD來研究雄性和雌性大鼠的冷敏感性。當在24°C、10°C和2°C的冰點以上溫度對實驗對象進行評估時，可以觀察到雄性和雌性在行為表現上的差異。

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訓練方案：

在每次使用前后以及不同實驗對象之間，都要徹底清潔口面部疼痛評估裝置。適當地照亮實驗場地。確保將不必要的外部刺激降至最低。除了OPAD系統的數據采集外，還可以使用跟蹤和視頻系統。

預訓練：

在OPAD中訓練之前，將實驗對象禁食適當的時間。將實驗對象放入籠子中，并將熱刺激器設置為非厭惡溫度。給實驗對象足夠的時間探索儀器。每周至少進行3次試驗，持續2周，或者直到觀察到一致的行為。

操作性程序最適用于無毛嚙齒動物。如果嚙齒動物有面部毛發，強烈建議使用適當的方法去除。確保只去除頰部毛發，而不是觸須墊/胡須，以免影響實驗對象的行為。在測試前1至2天進行毛發去除程序，以獲得準確的結果。在測試前進行處理。

在獎勵瓶中裝滿獎勵液體。將獎勵瓶放在支架上，使實驗對象必須用其頰部區域接觸熱刺激器才能舔到噴嘴。將實驗對象放入籠子中。如果實驗對象的觸須碰到獎勵瓶，或者頰部區域沒有接觸到熱刺激器，則進一步調整獎勵瓶的位置。將熱刺激器設置為所需溫度，并開始設定為預定試驗長度的試驗組。根據需要重復試驗。

數據分析：

• 舔舐：舔舐次數、每次舔舐的持續時間、第一次舔舐的潛伏期、最長舔舐時間、最短舔舐時間、舔舐頻率。

• 接觸：接觸次數、每次接觸的持續時間、第一次接觸的潛伏期、最長接觸時間、最短接觸時間。

• 比率：舔舐/面部接觸比率（L/F：獎勵舔舐事件數除以刺激接觸次數。每次有舔舐事件時就會產生接觸）是OPAD上痛覺感受的一個衡量指標。

口面部疼痛評估裝置使用獎勵-沖突范式來量化疼痛行為。這個簡單的裝置允許根據對溫度以及機械刺激的反應來評估疼痛參數。因此，能夠在單個系統內比較疼痛反應。該儀器允許比較治療組與未治療組的表現，以及不同疾病和損傷組的表現。

優點

操作性口面部評估裝置允許在單個系統內評估機械性和熱疼痛敏感性。該設置允許在相同的實驗參數下直接比較兩種模式下的表現。與傳統的疼痛檢測方法不同，OPAD依賴實驗對象的自愿行為。此外，由于該裝置不需要任何約束，對實驗對象來說壓力相對較小。

局限性

由于OPAD系統依賴自愿行為，訓練和測試可能很耗時。該任務要求實驗對象在訓練前禁食。這給實驗表現引入了一個食欲因素。熱模擬在無毛皮膚上效果較好。因此，有毛發的實驗對象在測試前必須去除毛發。成排的金屬絲可能無法均勻地施加機械刺激。實驗對象可能會通過傾斜頭部來分散機械刺激的效果。實驗對象的疼痛敏感性可能因其品系、年齡和性別而異。此外，嗅覺、聽覺或視覺等外部因素會影響任務表現。

案例解析：

Fig1 為了接觸裝滿甜煉乳的獎勵瓶，動物必須接觸一個由直徑為0.010英寸的環形不銹鋼絲組成的360°陣列。這種設計將因動物回避行為導致的誤差降至最低（A）。當動物接觸該陣列時（B），一個電機和螺紋桿會將獎勵瓶組件移得離籠子更遠（C）。動物必須持續讓頭部穿過機械刺激絲，才能獲取獎勵瓶。

實驗流程概述

1. 測試前禁食及操作：動物在測試前禁食12-15小時（過夜）。次日早晨，將動物置于丙烯酸測試箱內。當動物接觸獎勵瓶時，控制并記錄瓶子移動。重復該過程，直到收集到五次動物可耐受的獎勵瓶距離測量值，或測試時間達到10分鐘。每天為每只動物計算平均耐受距離。

2. 訓練期

適應階段：在兩周時間內，每周三次讓動物適應測試箱，期間動物可無障礙接觸獎勵瓶。

第三周：在水瓶前放置一個0.9英寸孔徑的陣列，每周繼續測試三次，獎勵瓶的最大停止距離從0.0英寸增加到0.25英寸，最后增加到0.5英寸。

第四周：將孔徑減小到0.7英寸，獎勵瓶的最大停止距離再次從0.0英寸增加到0.25英寸，再到0.5英寸。

第五周：允許動物跟隨獎勵瓶至其最大耐受閾值。

3. 辣椒素誘導的口面部疼痛實驗

辣椒素處理：訓練后，用異氟烷麻醉動物，在覆蓋咬肌直至觸須的皮膚上大量涂抹辣椒素乳膏。用溫水治療墊對涂抹辣椒素的區域進行加熱。5分鐘后，用濕紙巾擦去多余的辣椒素，讓動物在進行機械敏感性測試前恢復30分鐘。

機械敏感性測試：在辣椒素測試前1周（基線）、第0天涂抹辣椒素（辣椒素）、第3天不涂抹辣椒素（基線）、第7天涂抹辣椒素（辣椒素）、第10天不涂抹辣椒素（基線）、第14天涂抹辣椒素（辣椒素）、第16天不涂抹辣椒素（基線）時，進行口面部機械敏感性測試。

文獻引用：

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• Rossi HL, Neubert JK. Effects of environmental enrichment on thermal sensitivity in an operant orofacial pain assay. Behav Brain Res. 2008 Mar 5;187(2):478-82. doi: 10.1016/j.bbr.2007.09.021. Epub 2007 Sep 21. PMID: 17976833; PMCID: PMC2233846.

• Bowden LN, Rohrs EL, Omoto K, Durham PL, Holliday LS, Morris AD, Allen KD, Caudle RM, Neubert JK. Effects of cocoa-enriched diet on orofacial pain in a murine model. Orthod Craniofac Res. 2017 Jun;20 Suppl 1(Suppl 1):157-161. doi: 10.1111/ocr.12149. PMID: 28643911; PMCID: PMC5928773.

• Rohrs EL, Kloefkorn HE, Lakes EH, Jacobs BY, Neubert JK, Caudle RM, Allen KD. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. J Neurosci Methods. 2015 Jun 15;248:1-6. doi: 10.1016/j.jneumeth.2015.03.022. Epub 2015 Mar 28. PMID: 25823368; PMCID: PMC4417420.

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