Adv Sci . | PBLD 調控 STING 介導的抗病毒固有免疫應答與自身免疫性疾病

精確調控STING的表達對于維持免疫穩態、預防自身免疫性疾病至關重要。本研究發現，含吩嗪生物合成樣結構域蛋白（PBLD）通過抑制含CCDC50介導的STING 選擇性自噬降解，成為 STING 依賴性抗病毒 I 型干擾素應答的關鍵調控因子。值得注意的是，病毒感染通過兩種不同機制下調 PBLD 表達：一是通過降低轉錄因子TFEB活性抑制其轉錄，二是通過增強MARCH2介導的泛素 - 蛋白酶體途徑促進翻譯后降解。這些機制共同構成負反饋環路，助力病毒免疫逃逸。此外，與野生型（WT）同窩小鼠相比，Pbld 缺陷小鼠對人腺病毒4型（HAdV-4）感染的易感性顯著增加。重要的是，在 TMPD誘導的狼瘡小鼠模型中，Pbld缺陷可降低 STING 表達并減輕自身免疫表型。臨床層面，系統性紅斑狼瘡患者的 PBLD 表達升高，且與 STING 驅動的 I 型IFN 信號呈正相關。綜上，PBLD 在 STING 介導的抗皰疹病毒固有免疫及自身免疫中發揮雙重作用，其有望成為抗病毒感染和自身免疫性疾病的治療靶點。

研究結果一：PBLD缺陷減弱cGAS-STING介導的抗病毒免疫應答

為明確PBLD是否調控cGAS-STING介導的信號通路，本研究在HeLa細胞沉默及在MDBK細胞敲除實驗，探究其在DNA病毒或DNA模擬物觸發的I型IFN應答中的作用。結果發現，HAdV-4感染或DNA模擬物轉染后，沉默PBLD的HeLa細胞中I型IFN（IFNA、IFNB）和ISGs（ISG15、IFITM3、MX1）的mRNA表達顯著下調。一致地，BoHV-1感染后，PBLD敲除MDBK細胞中I型IFN和ISGs的mRNA表達也有所降低。此外，在HAdV-4或BoHV-1感染條件下，PBLD敲低/敲除可分別上調HAdV-4五鄰體基底（Pb）和BoHV-1 gE的 mRNA表達，表明PBLD缺陷會損害DNA病毒誘導的I型IFN應答并促進DNA病毒復制。

為進一步探究PBLD在原代細胞cGAS-STING信號通路中的調控作用，本研究從Pbld缺陷小鼠和WT小鼠中分離出小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）、腹腔巨噬細胞（PMs）和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）。HAdV-4感染或DNA模擬物刺激后，Pbld缺陷MEFs中Ifna4、Ifnb和ISGs（Isg15、Ifitm3、Mx1）的表達顯著降低，且HAdV-4病毒基因的表達較WT對照組上調。在HAdV-4感染的Pbld缺陷PMs和BMDMs中，也觀察到類似的I型IFN應答受損和病毒基因表達增加現象。綜上，這些結果表明PBLD在永生化細胞和原代細胞中均能促進cGAS-STING信號通路激活。

研究結果二：Pbld缺陷小鼠對HAdV-4感染的易感性顯著增加

為探究Pbld在體內抗病毒免疫中的生理和病理作用，本研究對Pbld敲除小鼠和WT小鼠進行鼻內HAdV-4感染，并開展綜合分析。HAdV-4感染后，與WT小鼠相比，Pbld缺陷小鼠血清中IFN-β的產生水平更低。感染24小時后，Pbld缺陷小鼠肺、肝、脾中Ifna4、Ifnb和ISGs（Isg15、Ifitm3、Mx1）的轉錄水平較WT小鼠顯著降低，而病毒載量則顯著升高。一致地，Pbld缺陷小鼠肺、肝、脾中HAdV-4的半數組織培養感染劑量（TCID??）也顯著高于對照組小鼠。此外，Pbld缺陷小鼠對HAdV-4誘導的致死性更為敏感。組織學分析顯示，HAdV-4感染的Pbld缺陷小鼠肺泡、細支氣管和氣管的蘇木精-伊紅（H&E）染色結果顯示，其組織損傷和炎癥細胞浸潤更為嚴重。綜上，這些結果表明PBLD在體內宿主抵御DNA病毒感染中不可或缺。

研究結果三：PBLD通過抑制CCDC50依賴性自噬降解穩定STING

為闡明PBLD激活cGAS-STING通路的分子機制，本研究首先探究了其對cGAS和STING穩定性的影響。實驗結果顯示，HAdV-4感染時，PBLD過表達可上調STING表達但不影響cGAS表達，而PBLD敲低則產生相反效果。在單純皰疹病毒1型（HSV-1）感染中，PBLD過表達或敲低也分別上調或下調STING蛋白表達。在HAdV-4或HSV-1感染的Pbld缺陷MEFs，以及HAdV-4感染的PMs和BMDMs中，也觀察到一致的結果。盡管RT-qPCR分析顯示HAdV-4或HSV-1感染后，PBLD可調控TMEM173（STING）的mRNA水平，但環己酰亞胺（CHX）追蹤實驗表明，PBLD敲除細胞中STING的降解速率較WT細胞增加，提示PBLD可穩定STING蛋白。這些結果表明PBLD在 mRNA和蛋白水平均能調控STING。

鑒于STING在調控cGAS-STING信號動態中的起重要作用，本研究利用藥物抑制劑進一步探究PBLD調控STING蛋白穩定性的機制。藥物阻斷實驗顯示，自噬抑制劑氯喹（CQ）可有效阻止PBLD缺失情況下的STING降解，而泛素-蛋白酶體抑制劑MG132或半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK則無此效果。此外，免疫熒光實驗表明，PBLD敲除可增強STING向溶酶體的定位，提示PBLD缺陷主要通過自噬溶酶體途徑促進STING降解。在自噬受損的自噬相關基因7敲除（ATG7-KO）HeLa細胞中，PBLD缺失情況下STING蛋白水平仍保持穩定，表明PBLD可抑制STING的自噬降解。

近期研究表明，自噬受體在調控選擇性自噬降解中發揮關鍵作用。在cGAS-STING通路中，包括SQSTM1/p62和CCDC50在內的多種自噬銜接蛋白已被證實可調控STING。為明確PBLD是否通過這些自噬受體調控STING降解，本研究進行了免疫共沉淀（co-IP）分析，結果顯示PBLD過表達可顯著破壞STING與自噬受體CCDC50的結合，而對SQSTM1/P62無影響；相反，PBLD敲除則產生相反效果。HAdV-4感染后，PBLD敲除細胞中CCDC50與STING的共定位較對照組增加。此外，在HAdV-4和HSV-1感染的PBLD敲低細胞中，CCDC50敲除可阻斷STING降解并增強IRF3磷酸化。綜上，這些結果表明PBLD通過功能性拮抗CCDC50介導的自噬降解，穩定STING蛋白。

研究結果四：PBLD減弱STING在K150位點的K48連接多泛素化

泛素鏈與底物的結合已被證實是自噬受體識別的信號。本研究推測PBLD可能通過影響STING的泛素化，進而調控其后續的CCDC50依賴性降解。為驗證這一假設，本研究探究了PBLD調控的特定泛素連接類型。實驗結果顯示，PBLD過表達可特異性降低STING的總泛素化和K48連接泛素化（僅K48泛素突變體），而對其他泛素連接類型（K6、K11、K27、K29、K33或K63僅泛素突變體）無影響。相反，PBLD敲除可增加STING的K48連接多泛素化，但不影響K63連接修飾。值得注意的是，病毒感染可增加STING的K48連接泛素化，且這種效應在PBLD缺陷細胞中進一步增強。

鑒于PBLD并非E3泛素連接酶，且免疫共沉淀實驗表明PBLD與STING之間無相互作用，本研究推測可能存在特定的中間分子介導STING的泛素化。為此，本研究在PBLD敲除和對照細胞系中進行了免疫沉淀聯合質譜分析，篩選出10個潛在的STING細胞相互作用因子。其中，本研究選擇了泛素A-52殘基核糖體蛋白融合產物1（UBA52），因其與泛素信號密切相關，可能在PBLD敲除后通過自噬調控STING降解。此外，HSV-1感染時，UBA52敲除可恢復PBLD敲低細胞中的STING蛋白水平。PBLD過表達可減弱STING與UBA52的相互作用，而PBLD敲除則產生相反效果，提示PBLD通過抑制UBA52與STING的結合，負向調控STING的自噬降解。

為進一步探究PBLD在UBA52介導的STING泛素化和降解中的調控作用，本研究構建了包含N端泛素結構域或C端核糖體蛋白L40（RPL40）的UBA52截短體。免疫共沉淀實驗顯示，UBA52的N端泛素結構域可特異性結合STING，而C端RPL40結構域則不能，提示UBA52來源的泛素可能修飾STING。正如預期，PBLD敲除或敲低可在UBA52過表達情況下顯著增加STING的泛素化，而UBA52缺陷則可減弱這種效應。為證實泛素來源于UBA52的切割，本研究構建了在泛素C端75/76位甘氨酸（G）突變為丙氨酸（A）的切割抗性（CR）UBA52表達載體（GFP-UBA52G75/76A）。實驗結果顯示，PBLD敲除可增強WT UBA52表達細胞中STING的泛素化，但對CR突變體表達細胞無此效果，證實UBA52蛋白水解產生的泛素對STING修飾至關重要。

隨后，本研究利用UbPred算法預測STING上的潛在泛素化位點，并構建了在三個潛在泛素化位點（K20、K137、K150）賴氨酸（K）突變為精氨酸（R）的STING突變體。在PBLD缺陷HeLa細胞中，K150突變（而非K20或K137突變）可消除PBLD敲低誘導的STING降解。值得注意的是，在HAdV-4感染的PBLD敲除細胞系中，UBA52可進一步增強WT STING和STING K20R/K137R突變體的降解，但對STING K150R突變體無此效果，提示STING的K150是其K48連接泛素化所必需的。綜上，PBLD通過抑制UBA52介導的STING在K150位點的K48連接泛素化，抑制STING的自噬降解。

研究結果五：PBLD通過減弱CCDC50識別的STING降解，促進STING介導的免疫應答

基于CCDC50敲除可消除PBLD敲低誘導的STING降解這一觀察結果，本研究推測UBA52介導的泛素化可能為CCDC50提供識別信號。為驗證這一假設，本研究分析了UBA52對STING與CCDC50相互作用的影響。PBLD敲低細胞中的免疫共沉淀實驗顯示，UBA52過表達可增強STING與CCDC50的結合，而UBA52敲除則減弱這種相互作用。此外，在PBLD缺陷細胞中，UBA52過表達誘導的STING降解可被自噬抑制劑CQ逆轉，但泛素-蛋白酶體抑制劑MG132無此效果，表明UBA52在STING自噬降解中發揮關鍵作用。

隨后，本研究探究了CCDC50在UBA52介導的STING降解中的作用。PBLD敲低細胞中，UBA52過表達可進一步促進STING降解，而CCDC50敲除則可消除這種效應。此外，本研究探究了CCDC50介導的STING降解是否參與抗病毒免疫。實驗結果顯示，UBA52過表達（單獨或與CCDC50聯合）可下調I型IFN和ISGs的表達，但在CCDC50敲除細胞中無此效果。這些結果表明PBLD通過抑制CCDC50介導的STING自噬降解，促進cGAS-STING信號激活。

利用重組WT STING或突變體STING（STING K150R）的STING敲除HeLa細胞系，本研究觀察到PBLD敲低情況下，UBA52和CCDC50可協同促進WT STING降解，但對STING K150R突變體無此效果，提示PBLD以K150依賴的方式靶向并穩定STING。功能分析進一步顯示，在UBA52和CCDC50存在的情況下，與WT STING相比，STING K150R突變體無法影響HAdV-4誘導的I型IFN應答。一致地，PBLD敲除可增強WT STING與CCDC50的相互作用，但對STING K150R突變體的影響極小。綜上，這些結果表明PBLD可有效抑制UBA52介導的STING在K150位點的K48連接泛素化，從而阻止STING降解，最終維持STING介導的免疫應答。

研究結果六：病毒感染通過TFEB和MARCH2下調PBLD表達

前期研究表明，某些RNA病毒感染可下調PBLD表達。為拓展這一發現，本研究探究了DNA病毒感染對PBLD表達的影響。實驗結果顯示，HSV-1和HAdV-4感染可在 mRNA和蛋白水平下調PBLD表達。鑒于TFEB在調控PBLD轉錄中的已知作用，本研究探究了DNA病毒感染過程中TFEB的動態變化。值得注意的是，HSV-1和HAdV-4感染均可在mRNA和蛋白水平抑制TFEB表達。此外，無論是否存在病毒感染，TFEB敲低均可下調PBLD的mRNA和蛋白表達，而TFEB過表達則產生相反效果。這些結果表明，TFEB介導的PBLD轉錄調控是病毒感染進一步下調TFEB表達、進而抑制PBLD轉錄的共同機制。

DNA病毒感染細胞中PBLD蛋白水平也顯著降低。環己酰亞胺（CHX）追蹤實驗顯示，HSV-1或HAdV-4感染可增強HeLa細胞中PBLD的降解。為明確這一效應的主要降解途徑，本研究利用針對不同降解途徑的抑制劑檢測PBLD蛋白水平。Westernblot分析顯示，泛素-蛋白酶體抑制劑MG132可恢復HAdV-4或HSV-1感染后的PBLD水平，而自噬抑制劑（CQ）和半胱天冬酶抑制劑（Z-VAD-FMK）則無此效果，提示泛素-蛋白酶體途徑參與這一過程。

前期研究報道，E3連接酶MARCH2在病毒感染過程中可作為MAVS和NF-κB介導信號的負調控因子，其與PBLD在MAVS和NF-κB介導的固有免疫應答中的正向調控作用呈負相關。因此，本研究推測MARCH2可能參與調控PBLD表達。隨后，分子對接預測了MARCH2與PBLD之間的相互作用。DNA病毒感染可在mRNA和蛋白水平顯著上調MARCH2表達。此外，MARCH2過表達可降低PBLD蛋白表達，而siRNA介導的MARCH2敲低則產生相反效果。為闡明MARCH2與PBLD之間的機制關聯，本研究探究了MARCH2在調控PBLD穩定性中的作用。DNA病毒感染可促進PBLD的K48連接泛素化，且MARCH2過表達可進一步增強這種泛素化，但對K63連接泛素化無影響，提示MARCH2可能通過介導PBLD的K48連接多泛素化促進其降解。一致地，RNA病毒感染也可在轉錄和蛋白水平下調TFEB并上調MARCH2表達。這些結果表明，DNA和RNA病毒感染均通過抑制TFEB表達下調PBLD轉錄，同時通過上調MARCH2介導的泛素-蛋白酶體途徑促進PBLD降解。

研究結果七：PBLD缺陷減輕TMPD誘導的小鼠狼瘡模型中的自身免疫

越來越多的證據表明，cGAS-STING信號通路的異常激活在SLE的發病機制中發揮關鍵作用。鑒于PBLD在調控STING介導的I型IFN信號中的重要作用，本研究探究了PBLD是否參與SLE的發病機制。為明確PBLD在SLE中的潛在功能，本研究建立了TMPD誘導的小鼠狼瘡模型（常用的小鼠狼瘡模型之一）。對6周齡雌性Pbld敲除小鼠和WT小鼠進行TMPD注射，并監測疾病進展。

與SLE的全身性炎癥特征（累及多個器官）一致，TMPD處理的WT小鼠較Pbld缺陷小鼠出現更嚴重的炎癥反應，表現為脾臟和腎臟腫大及器官重量增加。狼瘡性腎炎是SLE的關鍵病理特征，以腎小球免疫復合物沉積及尿素氮和肌酐升高為特征。TMPD處理后，對照組小鼠的肌酐和尿素氮水平顯著高于Pbld缺陷小鼠。腎臟組織的H&E染色顯示，TMPD處理的WT小鼠較Pbld缺陷小鼠出現更嚴重的炎癥細胞浸潤。此外，對TMPD處理的WT小鼠和Pbld缺陷小鼠BMDMs的TCGA數據集進行RNA測序（RNA-seq）分析，結果顯示PBLD表達與SLE相關通路（尤其是免疫系統過程相關通路）顯著相關。一致地，RNA-seq數據顯示，TMPD處理后，WT小鼠的Tmem173 mRNA表達較Pbld缺陷小鼠升高，提示TMPD誘導的狼瘡小鼠模型中，PBLD缺陷可減輕自身免疫表型。

為探究TMPD誘導的SLE小鼠中I型IFN通路的激活情況，本研究對PMs和BMDMs進行了分析，結果顯示與WT對照組相比，Pbld缺陷小鼠的PMs和BMDMs中TMPD誘導的Ifna、Ifnb、Isg15、Ifitm3、Mx1和Isg20表達受損。一致地，TMPD處理后，WT小鼠腎臟中這些 mRNA的表達較Pbld缺陷小鼠升高，與PBLD在調控這些基因表達中的正向作用一致。值得注意的是，WT組腎臟中的STING表達顯著高于Pbld缺陷對照組。此外，與礦物油處理對照組相比，TMPD處理的WT小鼠腎臟中STING的泛素化降低。鑒于PBLD表達受TFEB和MARCH2調控，本研究檢測了它們的表達，結果顯示TMPD處理可上調Tfeb并下調March2，提示TFEB和MARCH2的失調可能在SLE中調控PBLD表達。綜上，這些結果表明Pbld缺陷可減輕TMPD誘導的狼瘡模型中的自身免疫表型和免疫應答。

研究結果八：SLE患者中PBLD表達上調且與疾病進展呈正相關

鑒于PBLD在TMPD誘導的狼瘡小鼠模型中調控STING介導的I型IFN應答的重要作用，本研究探究了其在SLE患者中的表達模式。利用來自公共基因表達綜合數據庫（GEO）的四個獨立隊列（GSE121239、GSE112087、GSE72509、GSE49454）對PBLD表達進行整合分析，結果顯示與健康對照組相比，SLE患者的PBLD mRNA顯著上調。值得注意的是，在SLE患者中，PBLD表達與IFN表達呈正相關。此外，這些患者中PBLD表達水平與I型IFN通路激活呈正相關。隨后，本研究利用疾病活動指數（SLEDAI）重新分析了兩個公共數據集（GSE49454和GSE121239），結果顯示PBLD mRNA水平與SLE疾病活動指數呈正相關，表明PBLD表達與SLE的疾病嚴重程度相關。

為進一步探究SLE患者中TFEB是否調控PBLD表達，本研究利用兩個公共數據集（GSE21239和GSE72509）進行整合分析，結果顯示SLE患者的TFEB mRNA水平顯著高于健康供體。一致地，SLE患者的MARCH2 mRNA水平顯著低于健康供體，支持TFEB和MARCH2失調導致SLE中PBLD上調的假設。值得注意的是，與健康對照組相比，SLE患者的臨床血液樣本中PBLD、IFNA、IFNB和ISGs（ISG15、CXCL10、CCL5、IFIT1、IFIT2、STING、TFEB）的mRNA水平顯著上調，而MARCH2表達下調。綜上，這些結果表明PBLD表達上調可促進STING介導的通路，進而加劇SLE患者中I型IFN的異常激活。

綜上所述，本研究圍繞含吩嗪生物合成樣結構域蛋白PBLD展開，揭示其在STING介導的免疫調控中的關鍵作用：PBLD 通過抑制CCDC50介導的 STING 選擇性自噬降解，正向調控 STING 依賴性抗病毒固有免疫應答，而病毒感染會通過降低轉錄因子TFEB活性抑制 PBLD 轉錄、增強MARCH2介導的泛素 - 蛋白酶體途徑促進 PBLD 降解，形成負反饋環路助力病毒免疫逃逸，且 Pbld 缺陷小鼠對 HAdV-4感染易感性顯著增加；同時，在 TMPD誘導的狼瘡小鼠模型中，Pbld 缺陷可降低 STING 表達并減輕自身免疫表型，臨床研究亦發現系統性紅斑狼瘡（SLE）患者 PBLD 表達升高且與 STING 介導的 I 型干擾素信號正相關。綜上，PBLD 在 STING 介導的抗皰疹病毒固有免疫及自身免疫中發揮雙重作用，為抗病毒感染與自身免疫性疾病的治療提供了潛在靶點。

文章來源： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41204829/