近日,華中農業(yè)大學聯(lián)合崖州灣國家實驗室等單位在Molecular Therapy期刊上發(fā)表最新研究成果。崖州灣國家實驗室趙書紅教授、華中農業(yè)大學李新云教授和謝勝松教授為該論文的共同通訊作者。
該研究獲得一種新型Cas12a變體——PcuCas12a MAX(亦稱Gs12-7MAX),展現(xiàn)出優(yōu)異的基因組編輯性能。研究團隊還鑒定出四種具有不同單鏈DNA反式切割活性的Cas12a變體。研究團隊從海量微生物宏基因組數(shù)據(jù)中成功識別出多個此前未被表征的Cas12a家族新成員。通過系統(tǒng)篩選出21種蛋白結構保守但氨基酸序列高度分化的候選蛋白,并系統(tǒng)評估其順式與反式切割活性。
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高保真PcuCas12a MAX,可實現(xiàn)多物種高效精準基因組編輯。通過比較順式切割活性,研究團隊發(fā)現(xiàn)PcuCas12a在候選蛋白中具有最高的核酸內切酶活性。在此基礎上,結合結構預測指導的蛋白質工程化改造,成功構建了高保真變體PcuCas12a MAX。活性評估結果顯示,PcuCas12a MAX在HEK293T細胞中的平均編輯效率與已知高活性變體AsCas12a Ultra相當,而GUIDE-Seq全基因組脫靶分析進一步表明,其編輯特異性顯著優(yōu)于后者。
研究重點評估了PcuCas12a MAX的跨物種基因組編輯能力。在小鼠模型中,針對Tyr基因的胚胎顯微注射高效獲得了白化表型F0代小鼠,驗證了該工具在制備基因編輯動物模型中的高效性。
反式切割活性特異的Cas12a新變體,助力實現(xiàn)CRISPR多重核酸檢測。通過比較反式切割活性,研究團隊發(fā)現(xiàn)LcoCas12a、FcaCas12a、EsoCas12a和Mac2Cas12a四種新型Cas12a同源物,在與工程化改造的CRISPR RNA配對后,展現(xiàn)出獨特的單鏈DNA反式切割特征。
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