Nature｜張楹/殷昊團(tuán)隊(duì)聯(lián)合開發(fā)高效定點(diǎn)基因?qū)懭牍ぞ摺猀uadPE

基因作為遺傳信息的基本載體，儲(chǔ)存并傳遞著生命體構(gòu)建所需的全部指令。一旦基因特定區(qū)域發(fā)生突變或功能缺陷，便可能引發(fā)多種遺傳病。超過95%的遺傳病尚無根治手段，大多數(shù)患者仍長期面臨嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)與沉重的家庭負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)基因治療主要依賴病毒載體將功能正常的基因?qū)爰?xì)胞，但該策略仍存在 諸多 局限，包括潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn) 、非 整合載體難以維持長期療效等問題。

CRISPR-Cas9技術(shù)顯著推動(dòng)了基因編輯 領(lǐng)域 的發(fā)展， 其 可高效誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂并依賴內(nèi)源修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)小規(guī)模序列改造。然而，遺傳病致病突變類型復(fù)雜且高度異質(zhì)，針對(duì)單一突變的編輯策略難以覆蓋全部患者。因此， 需開發(fā)高效的定點(diǎn) 基因?qū)懭?技術(shù)，實(shí)現(xiàn)完整功能基因的精準(zhǔn)插入，從而同時(shí)應(yīng)對(duì)多種突變類型，提升 基因 治療的普適性。

202 6年 4 月 22 日， 武漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院 張楹 教授與 殷昊 教授課題組 聯(lián)合 在 Nature 期刊發(fā)表題為 Quadruple pegRNA enables programmable and efficient large genomic insertion 的研究論文。 團(tuán)隊(duì) 開發(fā) 了一種 高效的定點(diǎn)基因?qū)懭爰夹g(shù)QuadPE，該技術(shù) 以可編程的方式高效地 將千堿基級(jí)DNA（1.6至26 kb）插入基因組中。區(qū)別于整合酶介導(dǎo)的插入，QuadPE無需額外蛋白參與，通過一步法完成整合， 顯著提升了插入長度、效率及精準(zhǔn)度，為基因治療提供突破性的工具。

定點(diǎn)基因?qū)懭胧?實(shí)現(xiàn)致病突變 精準(zhǔn)替換的理想策略， 也是基因編輯領(lǐng)域長期亟待突破的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。 然而， 現(xiàn)有DNA 定點(diǎn)整合 系統(tǒng)存在兩大技術(shù)瓶頸： （1）插入片段長度和插入效率受限， 插入片段長度增加，效率顯著下降 ；（2） 依賴 細(xì)胞周期 ，在 疾病治療的慢速 分裂細(xì)胞 中效率低下。先導(dǎo)編輯技術(shù)（ Prime Editing, PE）能夠在基因組 定點(diǎn) 高效生成3’ flap這一關(guān)鍵中間結(jié)構(gòu)。 團(tuán)隊(duì)前期研究表明， 成對(duì)使用PE系統(tǒng) 可產(chǎn)生一對(duì)序列互補(bǔ)的3 ’ f lap, 其空間構(gòu)型直接決定編輯結(jié)局 ：在PAM-out構(gòu)型中，互補(bǔ)的3’ flap促進(jìn)兩個(gè)切口之間基因組序列的重復(fù) ( Cell, 202 4 )；而在PAM-in構(gòu)型中，則可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的精準(zhǔn)插入，同時(shí)刪除兩切口之間的原有基因組片段 ( Nature Methods , 2022) 。基于此，本研究提出：通過設(shè)計(jì)使 flap末端序列與外源供體DNA兩端形成互補(bǔ)配對(duì)， 有望 引導(dǎo)外源DNA按照 預(yù)設(shè) 方向精準(zhǔn)拼接 至 基因組，實(shí)現(xiàn)高效、可控的大尺寸DNA片段定點(diǎn)整合。 系統(tǒng)性篩選 24種組合后發(fā)現(xiàn) ， 使用兩對(duì)PE協(xié)同作用可獲得最優(yōu)插入效率，其中一對(duì)PE以 PAM-in或PAM-out 構(gòu)型 靶向基因組產(chǎn)生兩條3 ’flap（圖1：flapA/B）作為引物，另一對(duì)PE靶向供體DNA生成互補(bǔ)的 3 ’flap（圖1： f lap C/D ），從而引導(dǎo)供體DNA定點(diǎn)整合至目標(biāo)位點(diǎn)（圖1）。值得注意的是，基因組上 PAM-out設(shè)計(jì) 的 效率較PAM-in提高約1.5倍， 且 環(huán)形供體較線性供體具有更高 整合 效率 ， 這 暗示著P AM-out 設(shè)計(jì) 可能 在機(jī)制上 模擬外源 病毒 DNA或內(nèi)源轉(zhuǎn)座元件整合過程中，在插入位點(diǎn)兩端形成短片段重復(fù)序列的特 征。

圖1 QuadPE示意圖

QuadPE利用先導(dǎo)編輯器分別在基因組和供體DNA模板上生產(chǎn)序列互補(bǔ)的2對(duì)引物（flap A/C, flapB/D ）。在引物配對(duì)的引導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)基因精準(zhǔn)插入。

QuadPE系統(tǒng)在多個(gè)基因位點(diǎn)及多種細(xì)胞類型中展現(xiàn)出良好的普適性。在HEK293T和K562等細(xì)胞系中，可在多個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)1.6–9.5 kb外源片段的高效插入，最高效率可達(dá)40%。在Huh-7、Jurkat、Hepa1-6及小鼠胚胎干細(xì)胞中均 可 實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的整合。 進(jìn)一步 ，QuadPE可 介導(dǎo) 長達(dá)15 kb 乃至 26 kb的大片段DNA 插入 ， 顯示 其在不同細(xì)胞背景、靶點(diǎn)及插入長度條件下均保持較高且穩(wěn)定的編輯活性。與現(xiàn)有 基因?qū)懭?技術(shù)相比，QuadPE在 不同 插入 長度范圍內(nèi) 均 展現(xiàn) 顯著優(yōu)勢(shì)， 當(dāng)插入片段為9 .5 kb時(shí)， 其效率較整合酶體系eePASSIGE提高約11倍、較eePASTE提高約61倍，并 比 轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)evoCAST提高約12倍。同時(shí)，通過插入GFP報(bào)告基因， 觀測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明 QuadPE可實(shí)現(xiàn)外源序列的穩(wěn)定表達(dá)， 具 有良好的應(yīng)用前景。

為評(píng)估QuadPE對(duì)細(xì)胞周期的依賴性，本研究分別 使用帕博西尼 （ Palbociclib ） 和胸苷 （ thymidine ） 將K562細(xì)胞阻滯于G1期和G1/S期 ，結(jié)果顯示在細(xì)胞周期阻滯條件下仍能實(shí)現(xiàn)高效基因?qū)懭?。 進(jìn)一步，在 原代 非分裂 小鼠神經(jīng)元 中 ，QuadPE 介導(dǎo)的 4.6kb 片段插入效率高達(dá) 12.5% ，在原代人T細(xì)胞多個(gè)基因位點(diǎn)中，最高編輯效率可達(dá)51%。上 述結(jié)果表明，QuadPE不僅在增殖細(xì)胞中 保持高活性 ，在非分裂細(xì)胞及多種原代細(xì)胞中 同樣具有 穩(wěn)定 而高效的編輯能力 ，具有廣泛的應(yīng)用潛力。

在精準(zhǔn)性與安全性評(píng)估方面，本研究 通過overlap PCR、out-out PCR及Sanger測(cè)序確認(rèn)目標(biāo)片段的正確整合 ，并 對(duì)基因組 與 供體連接位點(diǎn)進(jìn)行 深度測(cè)序 ，精準(zhǔn)連接 比例 高達(dá)約96.7% 。 同時(shí)， 對(duì)QuadPE進(jìn)行 全基因組范圍內(nèi) 脫靶整合進(jìn)行分析 ， 未檢測(cè)到明顯脫靶插入事件，表明 QuadPE在實(shí)現(xiàn)高效 定點(diǎn)基因?qū)懭?的同時(shí)，具有 優(yōu)異的 編輯精度和極低的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，本研究開發(fā)的QuadPE系統(tǒng)突破了傳統(tǒng)基因組插入技術(shù)在效率、長度及細(xì)胞周期依賴性方面的瓶頸，實(shí)現(xiàn)了無需外源整合酶參與的可編程大片段精準(zhǔn)插入，并在多種細(xì)胞類型（包括非分裂細(xì)胞和原代細(xì)胞）中展現(xiàn)出高效的編輯性能且?guī)缀鯚o脫靶效應(yīng)，對(duì)高度異質(zhì)性的遺傳病提供了一種更具普適性的治療策略。

該論文 的 第一作者為武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院 博士后史亞晶 、 研究生丁梓怡和吳瑩 ， 武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院張楹教授和 殷昊 教授 為 共同 通訊作者。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10395-w

制版人： 十一

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