浙江
小師妹
這稿件直接決定我是否按時畢業(yè)，可審稿人反饋說里面的 WB 數(shù)據(jù)可信度不足，這條帶那么清晰，為什么被質(zhì)疑真實性？
你的內(nèi)參和目標(biāo)蛋白的信號是不是沒在同一張膜上？
大師兄
小師妹
分子量有差異，肯定要裁膜并分步孵育抗體，同一張膜上呈現(xiàn)信號，這不是為難我嗎？
我們可以用雜志推薦的總蛋白歸一化，全膜同時檢測目的蛋白和總蛋白，無需染色就可以獲取目的蛋白表達差異，還不用擔(dān)心內(nèi)參跑不齊。如果不做，可能會出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差，導(dǎo)致生物學(xué)結(jié)論誤判，審稿人自然會質(zhì)疑結(jié)果的可靠性。
大師兄
隨著期刊雜志對 WB 數(shù)據(jù)的要求越來越嚴格，提供帶 marker 的全膜圖像已逐漸變成數(shù)據(jù)提交的基本要求。大部分期刊如
Nature、Cell、JBC、J CELL BIOCHEM等已經(jīng)加強對 WB 實驗數(shù)據(jù)的要求，涉及原始圖片提交、泳道分割和 Marker 等等。但是由于抗體特異性和表達量差異，大多數(shù)情況下需要裁膜、洗膜分別獲取內(nèi)參和目的蛋白的信號， 總蛋白歸一化就通過量化全泳道的蛋白總量來校準數(shù)據(jù)，能有效消除上樣誤差、轉(zhuǎn)膜效率差異等干擾。本文將聚焦歸一化策略，助你獲取更可靠的 WB 數(shù)據(jù)！
為什么要做歸一化計算？
WB 實驗涵蓋樣本制備、上樣電泳、轉(zhuǎn)印封閉到孵育成像等環(huán)節(jié)，通常需 1~2 天才能獲得可分析數(shù)據(jù)。實驗人員的操作習(xí)慣與環(huán)境條件均可能對最終結(jié)果產(chǎn)生顯著影響（如圖1）。
圖1. 不同實驗人員使用同一樣品進行 WB 實驗定量分析
圖 1 所示為三位實驗人員使用同一樣品獲得的 WB 結(jié)果，Cy3（綠色）為目標(biāo)蛋白，Cy5（紅色）為總蛋白。在同一張膜上，直接使用 Cy3 目標(biāo)蛋白信號計算，不同泳道間 CV 值 >6%。利用 Cy5 進行歸一化后 CV 值由最大 9.8% 降低至 5%。結(jié)果表明實驗中需依賴參比數(shù)據(jù)才能提高定量準確性。
總蛋白歸一化的必要性
WB 實驗中，傳統(tǒng)內(nèi)參常選用看家蛋白（如 GAPDH、β-Actin、Tubulin），其理想特性為不受實驗及病理條件影響的內(nèi)源性穩(wěn)定表達。但大量文獻證實，在組織差異、細胞應(yīng)激、藥物處理、疾病模型等多種實驗條件下，這類蛋白的表達水平會顯著波動。例如，缺氧、代謝紊亂等病理條件可誘導(dǎo) β-actin 表達下調(diào)，細胞周期同步化處理會導(dǎo)致 GAPDH 表達不穩(wěn)。
鑒于傳統(tǒng)內(nèi)參的局限性，基于泳道總蛋白信號進行參比計算的「總蛋白歸一化」方法，逐漸獲得科研領(lǐng)域認可，例如《
Journal of Biological Chemistry》已明確推薦該方法用于 WB 數(shù)據(jù)歸一化（圖 2）。
圖 2. JBC 雜志對歸一化計算的方法要求
以 CHO 細胞裂解液樣品為例，梯度稀釋后進行 2 次重復(fù)上樣，計算 ERK1/2 蛋白分別使用總蛋白、看家蛋白 Tubulin、Actin、GAPDH 進行歸一化時的變異系數(shù) CV 值（圖 3.4）。
圖 3. 總蛋白歸一化結(jié)果
圖 4. 看家蛋白歸一化結(jié)果
最終統(tǒng)計結(jié)果顯示，總蛋白歸一化后的 CV 值僅 7%，而看家蛋白普遍 >10%。使用總蛋白歸一化的方式可以有效降低上樣差異和內(nèi)參蛋白表達差異，有利于獲得更真實的表達量變化。
如何做蛋白歸一化計算？
1、樣品標(biāo)記
Cytiva Amersham Quick Stain（貨號：RPN 4000）總蛋白檢測試劑盒以 40 ul WB 實驗體積為例：
1. 19 ul 樣品裂解液+1 ul Cy5 染料工作液混勻；
2. 室溫孵育 3-30 分鐘；
3. 加入 20 ul 2xLoading buffer 混勻；
4. 95 ℃ 加熱 3 分鐘后短暫離心準備電泳上樣；
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2、印跡膜選擇指南
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3、封閉孵育
Amersham ECL 封閉劑
每包含 40 g 封閉試劑，可完成 >20 次的小量封閉實驗，與 ECL 檢測試劑配合使用效果更佳。
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Amersham ECL HRP 偶聯(lián)二抗
具有高種屬特異性，與 ECL 檢測試劑配合使用，可以最優(yōu)稀釋比例獲得更低背景。
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Amersham ECL Plex CyDye 偶聯(lián)二抗
它是 ECL Plex、Cy3 及 Cy5 偶聯(lián)的抗體，利用 CyDye 熒光標(biāo)記，可進行多波長掃描，無需 Stripping 和 Reprobing，減少誤差，高特異性檢測蛋白。
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Amersham CyDye NIR 二抗
Amersham CyDye 700 和 800 二抗標(biāo)記有 NIR熒光團，可發(fā)射 700 nm 或 800 nm 波長的光。Amersham cyDye 700 和 800 二抗與一對合適的免或小鼠一抗配合使用，可以實現(xiàn)多重實驗。
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4、成像
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5、分析
IQTL-Blot Analysis
1. 打開需要分析的圖片；
2. 泳道識別、背景扣除、條帶識別（目的蛋白）；
3.在均一化中方法選擇 Total Protein，參比通道選擇熒光，均一化因子選擇 Total Lane Volume；
4. 以柱狀圖或表格形式展示，結(jié)果以圖片、PDF 報告或文檔形式導(dǎo)出。
內(nèi)容策劃：王丹琦
內(nèi)容審核：周育紅
題圖及文中圖片來源：Cytiva 思拓凡
特別聲明：以上內(nèi)容(如有圖片或視頻亦包括在內(nèi))為自媒體平臺“網(wǎng)易號”用戶上傳并發(fā)布，本平臺僅提供信息存儲服務(wù)。
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