浙江
小師妹
這稿件直接決定我是否按時畢業，可審稿人反饋說里面的 WB 數據可信度不足，這條帶那么清晰，為什么被質疑真實性？
你的內參和目標蛋白的信號是不是沒在同一張膜上？
大師兄
小師妹
分子量有差異，肯定要裁膜并分步孵育抗體，同一張膜上呈現信號，這不是為難我嗎？
我們可以用雜志推薦的總蛋白歸一化，全膜同時檢測目的蛋白和總蛋白，無需染色就可以獲取目的蛋白表達差異，還不用擔心內參跑不齊。如果不做，可能會出現系統性偏差，導致生物學結論誤判，審稿人自然會質疑結果的可靠性。
大師兄
隨著期刊雜志對 WB 數據的要求越來越嚴格，提供帶 marker 的全膜圖像已逐漸變成數據提交的基本要求。大部分期刊如
Nature、Cell、JBC、J CELL BIOCHEM等已經加強對 WB 實驗數據的要求，涉及原始圖片提交、泳道分割和 Marker 等等。但是由于抗體特異性和表達量差異，大多數情況下需要裁膜、洗膜分別獲取內參和目的蛋白的信號， 總蛋白歸一化就通過量化全泳道的蛋白總量來校準數據，能有效消除上樣誤差、轉膜效率差異等干擾。本文將聚焦歸一化策略，助你獲取更可靠的 WB 數據！
為什么要做歸一化計算？
WB 實驗涵蓋樣本制備、上樣電泳、轉印封閉到孵育成像等環節，通常需 1~2 天才能獲得可分析數據。實驗人員的操作習慣與環境條件均可能對最終結果產生顯著影響（如圖1）。
圖1. 不同實驗人員使用同一樣品進行 WB 實驗定量分析
圖 1 所示為三位實驗人員使用同一樣品獲得的 WB 結果，Cy3（綠色）為目標蛋白，Cy5（紅色）為總蛋白。在同一張膜上，直接使用 Cy3 目標蛋白信號計算，不同泳道間 CV 值 >6%。利用 Cy5 進行歸一化后 CV 值由最大 9.8% 降低至 5%。結果表明實驗中需依賴參比數據才能提高定量準確性。
總蛋白歸一化的必要性
WB 實驗中，傳統內參常選用看家蛋白（如 GAPDH、β-Actin、Tubulin），其理想特性為不受實驗及病理條件影響的內源性穩定表達。但大量文獻證實，在組織差異、細胞應激、藥物處理、疾病模型等多種實驗條件下，這類蛋白的表達水平會顯著波動。例如，缺氧、代謝紊亂等病理條件可誘導 β-actin 表達下調，細胞周期同步化處理會導致 GAPDH 表達不穩。
鑒于傳統內參的局限性，基于泳道總蛋白信號進行參比計算的「總蛋白歸一化」方法，逐漸獲得科研領域認可，例如《
Journal of Biological Chemistry》已明確推薦該方法用于 WB 數據歸一化（圖 2）。
圖 2. JBC 雜志對歸一化計算的方法要求
以 CHO 細胞裂解液樣品為例，梯度稀釋后進行 2 次重復上樣，計算 ERK1/2 蛋白分別使用總蛋白、看家蛋白 Tubulin、Actin、GAPDH 進行歸一化時的變異系數 CV 值（圖 3.4）。
圖 3. 總蛋白歸一化結果
圖 4. 看家蛋白歸一化結果
最終統計結果顯示，總蛋白歸一化后的 CV 值僅 7%，而看家蛋白普遍 >10%。使用總蛋白歸一化的方式可以有效降低上樣差異和內參蛋白表達差異，有利于獲得更真實的表達量變化。
如何做蛋白歸一化計算？
1、樣品標記
Cytiva Amersham Quick Stain（貨號：RPN 4000）總蛋白檢測試劑盒以 40 ul WB 實驗體積為例：
1. 19 ul 樣品裂解液+1 ul Cy5 染料工作液混勻；
2. 室溫孵育 3-30 分鐘；
3. 加入 20 ul 2xLoading buffer 混勻；
4. 95 ℃ 加熱 3 分鐘后短暫離心準備電泳上樣；
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2、印跡膜選擇指南
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3、封閉孵育
Amersham ECL 封閉劑
每包含 40 g 封閉試劑，可完成 >20 次的小量封閉實驗，與 ECL 檢測試劑配合使用效果更佳。
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Amersham ECL HRP 偶聯二抗
具有高種屬特異性，與 ECL 檢測試劑配合使用，可以最優稀釋比例獲得更低背景。
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Amersham ECL Plex CyDye 偶聯二抗
它是 ECL Plex、Cy3 及 Cy5 偶聯的抗體，利用 CyDye 熒光標記，可進行多波長掃描，無需 Stripping 和 Reprobing，減少誤差，高特異性檢測蛋白。
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Amersham CyDye NIR 二抗
Amersham CyDye 700 和 800 二抗標記有 NIR熒光團，可發射 700 nm 或 800 nm 波長的光。Amersham cyDye 700 和 800 二抗與一對合適的免或小鼠一抗配合使用，可以實現多重實驗。
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4、成像
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5、分析
IQTL-Blot Analysis
1. 打開需要分析的圖片；
2. 泳道識別、背景扣除、條帶識別（目的蛋白）；
3.在均一化中方法選擇 Total Protein，參比通道選擇熒光，均一化因子選擇 Total Lane Volume；
4. 以柱狀圖或表格形式展示，結果以圖片、PDF 報告或文檔形式導出。
內容策劃：王丹琦
內容審核：周育紅
題圖及文中圖片來源：Cytiva 思拓凡
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