AAV和LV基因療法的致突變和致癌性風險評估

在過去的幾年中，FDA和EMA批準了多種基因治療(Gene Therapy, GT)藥物。ClinicalTrials.gov網站上顯示有1000多基因治療臨床試驗項目正在進行，覆蓋從腫瘤到隱性遺傳病等多個適應癥。基因治療通常會使用病毒載體遞送，可能存在一些安全問題，比如插入性突變的風險。監管機構建議對基于病毒載體的基因治療產品進行插入性突變風險評估。

美國毒理學學院第43屆年會中圍繞如何應對基因治療領域不斷出現的挑戰進行了討論。會議全面回顧了重組腺相關病毒載體（rAAV）和慢病毒載體（LV）相關的致突變性和致癌性風險的歷史和當前認知，并通過使用rAAV和LV作為案例，展示了如何在藥物開發過程中評估這種風險。本文略作分享。

當病毒載體意外整合到基因組中時，可能會發生載體介導的遺傳毒性，并可能會激活原癌基因，和/或導致插入性突變，進而可能破壞或失調基因表達，引發克隆擴增和腫瘤形成。如下圖所示。載體整合到基因組中涉及病毒和非病毒因素。病毒因素包括載體設計（是否存在強增強子和/或啟動子序列、是否存在剪接供體或受體位點以及有利于替代轉錄本生成的聚腺苷酸化信號）以及宿主整合位點（IS）或插入位點特征。非病毒因素包括轉基因功能、靶細胞、疾病狀態、年齡以及表觀遺傳因素等。

AAV遺傳毒性、整合和成瘤風險

AAV于1965年被發現，被認為是非致病性的。天然存在的AAV的組織嗜性取決于AAV的血清型。到目前為止，已鑒定出13種AAV（AAV1-AAV13）血清型。全球超過80%的人群對AAV呈陽性反應，AAV基因組在人類腫瘤和正常組織中均有發現，但缺乏克隆性。在20世紀90年代初，野生型AAV被發現具有高傾向整合到人類19號染色體的AAVS1位點。近年來，rAAV已被用于基因遞送，目前已有九種相關產品獲批。最近獲批的AAV基因治療藥物是Kebilidi，于2024年獲批。rAAV的整合較為罕見，主要是因為它們缺乏病毒載體中用于復制的Rep區域。然而，在人類中，當整合發生時，通常出現在染色體17和19的熱點區域（hotspots），如CpG島或核糖體DNA重復序列附近。

在小鼠中，rAAV傾向于插入基因調控元件、熱點區域或癌基因附近。在一系列針對黏多糖貯積癥VII型（MPSVII）、鳥氨酸轉氨甲酰酶（OTC）缺乏癥、桑德霍夫病或甲基丙二酸血癥的小鼠模型的研究中，新生小鼠接受治療后，13-24個月內出現了劑量依賴性的肝細胞癌（HCC），主要由于它們對rAAV整合和腫瘤生成的敏感性。這些研究還表明，在易患腫瘤的小鼠品系中，載體設計中的特定成分、載體DNA相關污染物等可能會增加載體整合和腫瘤生成的風險。在小鼠中，rAAV的整合主要發生在Rian位點內的Mir341。由于人類不攜帶Rian位點，因此rAAV在小鼠Rian位點整合導致的HCC與人體相關性尚不明確。

有趣的是，在接受rAAV基因治療的大動物中，尤其是接受單次基因治療的B型血友病和A型血友病犬（觀察期為8-10年），以及接受rAAV1、5或8基因治療的非人靈長類動物（觀察期為1-5年），并未報告HCC的發生。在單次接受AAV基因治療的血友病犬中，觀察到肝臟中有超過1700個整合位點，且在五只犬中發現了靠近細胞生長相關基因的擴增細胞克隆，但未出現肝結節或轉化。

目前，許多rAAV基因治療藥物正處于臨床試驗的不同階段，其中大多數處于I/II期。用于基因遞送的最常用AAV血清型是AAV2，其次是AAV8、AAV9和AAV1。目前為止，尚未在臨床試驗或已上市藥物中檢測到與rAAV基因治療相關的遺傳毒性。

需要明確的是，接受AAV基因治療的患者中確實有HCC的發生，尤其是肝臟靶向治療。這些患者發生HCC的主要原因包括：1）既往有病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（HCV）或人類免疫缺陷病毒（HIV）病史；2）存在晚期肝纖維化或早期肝硬化；3）野生型AAV2在癌基因中的整合。需要注意的是，目前尚不清楚缺乏Rep的rAAV基因治療載體是否會在人肝細胞中整合到癌基因中。AAV在人類基因組中的整合位點可能與小鼠基因組中的整合位點不同。總之，AAV與人類HCC風險增加之間的關系存在較大爭議，持反對意見的認為AAV的存在僅僅是相關性而非因果關系。

LV遺傳毒性、整合和成瘤風險

LVs是逆轉錄病毒載體（RVs）的重組形式。40多年來，RVs已被廣泛用于基因治療，主要用于單基因疾病、癌癥和傳染病。RVs能夠提供穩定（長期）且高效的轉基因表達。然而，第一代用于基因治療的RVs因插入性突變導致的不良事件而受到關注。從2003年到2011年，RV遞送的基因治療被證明會導致細胞增殖、染色體異常和致癌事件，包括骨髓增生異常綜合征和白血病，主要是由于插入導致的基因表達水平的改變。

2007年，研究發現RVs的共同插入位點（CIS）主要集中在特定區域，尤其是靠近MDS-EVI1、PRDM16、LMO2和CCNE2基因位點，但并非所有插入位點都與腫瘤風險增加相關。此外，CIS主要出現在轉錄活躍區域。隨后，為了克服早期RVs的安全性問題，研究人員開發了安全表現更好的RVs，例如改良的LVs。與其他僅能轉導分裂細胞的RVs不同，LVs可以轉導分裂和非分裂細胞，同時仍能提供穩定（長期）且高效的轉基因表達。

目前，LVs主要用于體外細胞修飾，以生成用于細胞治療的嵌合抗原受體（CAR）T細胞。LVs源自HIV，但它們是復制缺陷型的，并且經過多年的發展，已經從第一代、第二代進化到第三代，遺傳毒性風險更低。第一代LVs由于在構建中包含gag、pol和調控輔助蛋白（vif、vpr、vpu和nef），并且這些蛋白受細胞巨化病毒（CMV）啟動子的調控，因此具有較高的整合風險。第二代和第三代LVs的整合風險較低，因為調控元件已去除。其中，第三代LVs也被稱為自滅活LVs（SIN LVs），缺乏導致較高遺傳毒性風險的LTR區域中的增強-啟動子元件。盡管如此，由于LVs可能意外生成具備復制能力的病毒，以及非隨機基因組整合，LVs仍存在一定風險。

LVs的整合和遺傳毒性機制包括跨轉錄基因整合，主要在內含子中。SIN LVs可以通過以下方式導致遺傳毒性：1）當它們在內部位置攜帶強增強子-啟動子序列時，上調插入位點（IS）周圍基因的表達；2）誘導異常剪接和/或靶基因內源性轉錄本的提前終止，可能導致功能喪失或功能獲得性突變。

為了克服新一代LVs的遺傳毒性風險，目前正在開發非整合型LVs（NILVs）。NILVs旨在用于疫苗接種、癌癥治療、定點基因插入、基因破壞策略等。它們是通過在pol的整合酶區域引入突變生成的，這些突變分為I類或II類。I類突變阻止整合酶活性、基因組DNA結合和載體DNA結合，以及LVs整合酶的多聚化。II類突變不僅損害整合，還影響許多其他病毒生命周期。I類突變更適合用于生成NILVs。盡管NILVs被設計為非整合型，至少不能通過整合酶機制，但還是存在一些非整合酶依賴的整合，通常發生在染色體斷裂位點，通過非同源末端連接（NHEJ）介導。潛在解決方案包括抑制雙鏈斷裂修復途徑中的細胞因子，或限制比超螺旋DNA整合效率更高的線性載體DNA。

迄今為止，FDA已批準了13種慢病毒載體細胞療法，其中最新的一種是TECELRA?，這是首個獲得FDA批準用于實體瘤治療的細胞療法。截至2024年11月，所有FDA批準的LV修飾細胞療法中，只有SKYSONA（用于治療腎上腺腦白質營養不良[CALD]）與人類的插入性突變相關。SKYSONA（Elivaldogene autotemcel或Eli-cel）是一種自體體外修飾細胞療法，使用lenti-D LV將攜帶ABCD1基因的cDNA添加到患者自身的CD34+造血干細胞中，然后將修飾后的細胞回輸到患者體內進行治療。在SKYSONA的臨床試驗中，67名患者中有3人在治療后5年內發展為造血惡性腫瘤，所有3例均為Lenti-D LV介導的插入性癌變。

在2022年FDA咨詢委員會會議上，與Bluebird bio和細胞治療領域的專家討論了SKYSONA的致癌機制，認為其與位于ABCD1 cDNA上游內部位置的強病毒啟動子MNDU3有關，該啟動子驅動所有造血譜系的高水平基因表達。整合主要發生在MECOM基因附近，這是一個已知的髓系癌基因，在54名接受治療的患者中，有53名發生了整合。其他插入位點包括PRDM16、MPL和MIR100HG。

CALD是一種進行性、不可逆且致命的神經退行性疾病，主要影響年幼男孩。SKYSONA在臨床試驗中表現出非常高的有效性，約87%的治療患者在長達7年內保持無事件生存，與早期活動性CALD的未治療患者相比，CALD相關事件減少了72%，大多數患者保持基線神經功能和正常智商。SKYSONA顯著優于現有的異體造血干細胞移植，且對于干細胞移植，患者需要等待很長時間才能找到匹配的細胞供體，或者接受不匹配的細胞供體，這會導致極高的移植物抗宿主病風險。而SKYSONA使用患者自身的細胞，消除了等待時間和移植物抗宿主病的風險。盡管存在腫瘤生成風險，但FDA認為SKYSONA對這種侵襲性和致命疾病的好處大于腫瘤生成風險，最終獲得批準。

關于插入突變的監管考慮

在2022年開會時，FDA批準的8種基因療法，其中7種未報告有致癌性，另外1種存在插入突變，但由于對患者有顯著獲益而獲批。

rAAV載體整合導致的致癌性僅在新生小鼠中被報道，且與小鼠特有的Rian基因座附近整合有關，而人類并不存在該基因座，因此在人類中尚未發現由其整合導致的腫瘤形成。此外，在接受治療后長達10年的大動物（如血友病犬）和長達6年的非人靈長類動物中，也未見有腫瘤形成的報道。

LVs主要整合到轉錄活躍的基因中，且多在內含子區域。載體構建中存在強啟動子-增強子元件是導致整合和高致瘤風險的主要因素。

通常情況下，FDA可能會要求對基因療法的基因組完整性進行評估，包括大片段插入或缺失、外源DNA整合、染色體重排以及通過評估克隆擴增或不受控增殖（僅針對體外修飾細胞）來判斷潛在的致癌性/插入突變風險。目前，FDA尚未出臺關于具體檢測方法或檢測指標要求（例如，cut off points）的明確指導。

由于存在整合和致癌的低風險，FDA及其他監管機構會根據證據權重（WoE）要求對基因療法患者進行5至15年的長期隨訪。

LV基因治療產品致突變性和成瘤性評估

與AAV不同，LV載體能夠將遺傳信息整合到宿主基因組中。LV也因其能夠穩定地將基因引入細胞并在細胞發育過程中傳遞給子代細胞而備受青睞。與早期的RVs相比，目前使用的第三代LV載體引入了多種元素和改良方案，顯著提高了其用于基因治療的安全性。

在LV載體基因治療產品臨床前評估致突變性和成瘤性的方法很多，比如采用體外工具評估載體整合和細胞轉化潛力，同時結合體內組織的整合位點分析（ISA），并采用以上結果開展致突變性和成瘤性風險的WoE評估。常用體外插入位點分析方法優缺點如下表所示。此外，在細胞和基因治療的臨床前安全性評估中，動物模型的選擇及其對終點（如成瘤性）的潛在影響也應被考慮。

基于病毒的基因治療載體：致突變性/致癌性風險評估的監管視角

一般藥理學與毒理學評估的作用

基于病毒的GT產品的載體整合風險，是需系統解決的非臨床安全性問題之一。對載體潛在整合風險的初步評估，始于對GT載體的全面表征，包括但不限于載體設計、關鍵質量屬性、主要放行標準，以及病毒基因組物質轉運至細胞核的固有能力、病毒蛋白的可獲得性，或其與細胞蛋白相互作用介導病毒遺傳物質轉運和/或整合的能力。

與AAV等生命周期中無DNA整合步驟的病毒載體相比，慢病毒等以DNA整合為生命周期一部分、經工程改造的GT載體，具有更高的插入突變和致癌風險。

產品特性相關信息將為初步藥理學和毒理學研究的設計與實施提供依據。在產品開發早期，早期研究和確定性研究的累積非臨床數據，將指導后續是否需要開展額外的載體整合和/或致瘤性研究。具體而言，對藥理學、生物分布、藥代動力學和毒理學研究的細致分析，是制定非臨床策略、決策是否需進一步評估靶向和非靶向組織/器官中載體整合、致突變性、遺傳毒性和/或致癌性風險的核心。

這種整體的WoE方法遵循分步、整合的決策流程，以科學為基礎、數據為驅動。需注意，特定GT產品的具體特性將決定非臨床研究策略的方向，只要有科學依據，策略可靈活調整。

在某些情況下，一般毒理學和其他非臨床研究的觀察結果可能表明，載體可能整合到影響細胞形態和生理功能的基因組位置，包括基因表達變化、細胞活力和增殖改變、持續性變化、器官重量/大小改變，和/或異常病變的出現，或導致器官毒性。對于觀察到的任何腫瘤或增生性病變，應調查其起源以及載體是否對腫瘤發生有影響。此外，還應考慮聯合治療的潛在毒性、研究動物和/或目標人群的免疫調節狀態，以及特定疾病適應癥/特定目標人群，這些因素可能會加重載體相關毒性或調節插入突變風險。

載體整合與致癌風險評估的非臨床考量

評估載體整合及插入突變、致癌風險時，需考慮的主要因素包括：GT載體是否為已知的整合型或非整合型載體、其固有的組織嗜性、是否存在基因組編輯組件、載體骨架設計、給藥途徑、給藥劑量水平、長期存續潛力、靶細胞/組織/器官對插入突變的敏感性，以及目標人群中易導致腫瘤形成的風險因素。

若有科學依據支持開展額外的載體整合和致癌性研究，需重點考慮以下非臨床研究要點：1）非臨床用產品（如早期版本或替代載體）與擬臨床用產品的可比性；2）所選動物種屬/疾病模型對目標適應癥/患者人群的代表性；3）研究設計與實施要素，包括足夠的研究持續時間（腫瘤形成所需）、設置合適的平行對照組、每組足夠的動物數量（以確保腫瘤形成本底發生率等生物學觀察結果的統計學意義）；4）研究終點；5）如果可行，非臨床研究應盡可能與臨床方案一致。

研究用的非臨床載體應在載體組成、病毒基因組滴度、生產工藝、最終制劑與儲存條件、轉導和/或編輯效率等方面，與擬臨床用載體盡可能一致，并符合主要產品放行標準。

選擇動物種屬或模型（包括用于評估插入突變的細胞/組織類型）時，需重點考慮：與人類的比較生理學/病理生理學差異、對載體轉導和/或基因組編輯的允許性、對產品的藥理反應，以及臨床遞送系統或流程的可行性。

載體和轉基因的生物分布評估是重要環節，可為是否需要開展整合和致癌性研究提供依據。設計非臨床研究時，應采用靈敏的定量方法檢測相關動物種屬的靶向和非靶向組織中的產品DNA序列，并妥善存檔/儲存收集的組織/器官，以備未來可能的載體整合等分析。若載體持續存在，藥物研發者應采用基于風險的方法評估整合和致癌潛力。有關設計、實施和解讀載體生物分布研究的更多指導，可參考《Guidance for Industry: Long-Term Follow-up After Administration of Human Gene Therapy Products (2020)》和《International Pharmaceutical Regulators Programme (PRP) Reflection Paper: Expectations for Biodistribution (BD) Assessments for Gene Therapy Products (June 2018)》。

插入突變與致癌風險的分步評估方法

用于評估載體整合風險的方法，應根據載體GT產品的具體生物學特性確定，包括靶轉導細胞、這些細胞的生長動力學潛力，以及轉基因表達動力學（若轉基因具有生長因子功能，則尤為重要）。一般而言，若某種測試方法能提供有用信息，幫助更好地理解載體基GT產品的插入突變風險和/或致癌潛力，則可考慮采用。

ICH S2 (R1)中描述的標準遺傳毒性評估方法不適用于病毒載體，因為這些技術主要關注DNA損傷或突變，且適用短時間暴露。載體介導的突變可能需要數周、數月甚至數年時間。用于檢測載體介導遺傳毒性的檢測方法應能夠可重復地定量插入性突變、測量基因功能的獲得或喪失，并確定插入在染色體中的位置。遺憾的是，監管機構尚未制定針對載體介導遺傳毒性風險評估的具體指南，也沒有明確檢測方法。根據病毒載體的不同，可使用多種檢測方法來評估遺傳毒性。對于基因編輯療法，這些檢測方法包括但不限于全基因組范圍的非靶向修飾分析（如插入/缺失定量和/或寡核苷酸整合）、插入位點分析、分子易位檢測（用于評估靶向位點之間或靶向位點與非靶向位點之間的易位事件）、核型分析、成纖維細胞軟瓊脂轉化試驗或低附著生長（GILA）試驗以及IL-2細胞增殖試驗。

體外永生化試驗（IVIM）和遺傳毒性評估替代試驗組合（SAGA）是兩種常用于評估整合型載體致突變潛力的體外試驗。這些研究結果可與長期非臨床體內研究的安全性終點（如腫瘤形成的大體和微觀證據、載體和轉基因在靶向和非靶向組織中的持續性，以及任何可能與基因組不穩定性或插入突變相關的延遲毒性）相關聯。

開展整合位點分析可確定載體整合的頻率和位置，并可根據所用方法提供克隆擴增相關信息。

載體整合和/或核酸酶介導的編輯事件的表征，可根據情況采用基于測序的方法和正交方法，包括計算機預測、深度測序或全基因組測序，以及生化和細胞方法。

從臨床角度來看，基于載體的持續性、整合和/或基因組修飾，可能需要進行長期隨訪（LTFU），以評估長期風險和延遲不良事件。

插入突變與致癌風險評估的挑戰與未來考量

評估多樣化的AAV或LV GT產品致癌風險的挑戰包括：確定致癌作用機制/過程；在選擇評估致瘤性/致癌潛力或預測臨床結果的最相關體外方法和動物模型方面，缺乏科學共識。目前仍需更好地理解人類面臨的風險、致癌性的潛在機制和影響因素，以及降低風險的潛在途徑。建議鼓勵科學界進一步研究這些問題，并在公共領域共享數據。

GT產品研發者必須在整個產品生命周期中，與藥品監管機構保持密切合作，盡早并持續提供反饋。這需要研發者熟悉監管機構的當前思路和監管框架、指導文件，并利用機會通過會議（正式或非正式）與監管機構就所研發GT產品的特定問題進行溝通。這些互動和會議的主要目標是獲得監管機構的有用反饋，幫助藥物研發者成功提交IND申請，并開發出有效且安全的藥物產品。

研發者在IND申報中常見的缺陷通常包括：評估目標人群風險的信息不足，包括產品表征不充分、非臨床安全性數據有限或缺失、安全性研究報告不完整、非臨床研究設計不當和/或實施不佳（如測試產品與擬臨床用產品存在重大差異、給藥途徑不相關、劑量水平不合適、研究持續時間不足、測試系統不適當/不相關、終點無臨床意義）。

總之，載體基GT產品插入突變和致癌風險的非臨床評估應遵循全面的WoE方法，并牢記非臨床研究的設計目的是支持特定產品用于特定臨床適應癥的給藥。

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