動物行為實驗指南丨捕食者氣味誘導的先天恐懼行為相關范式

先天恐懼是動物和人類規避危險的自然反應，嚙齒類動物主要通過嗅覺系統感知捕食者氣味（如狐貍糞便成分），產生主動回避和被動僵住兩種核心行為，以維持生存和心理健康。

嗅覺回避與躲避測試

（Olfactory avoiding and avoidance test）

該測試是研究nTMT誘導小鼠先天恐懼行為的核心，分為“躲避行為記錄”和“回避行為量化”兩部分，核心是通過3D運動捕捉追蹤小鼠對nTMT的主動規避反應。

實驗場景與設備：

測試空間：圓形開闊場（高度40cm、直徑50cm），四角安裝4臺高清數字相機以30幀/秒的速率記錄小鼠行為，確保捕捉行為細節的連續性和準確性。

刺激物處理：將蘸有未稀釋nTMT的濾紙置于密封盒中（避免操作時泄漏），實驗時放在小鼠的對側位置，作為先天恐懼刺激源。

前期適應：實驗前先讓小鼠在測試空間中適應，減少環境陌生感對行為的干擾。

行為定義與記錄規則：

嗅覺回避測試（Olfactory avoiding test）：聚焦小鼠對nTMT的即時躲避動作，判斷依據包括小鼠的鼻尖朝向、與濾紙的靠近動作及距離。當小鼠鼻尖與濾紙中心的距離超過20mm時，記為“躲避信號開始”；當小鼠鼻尖朝向發生改變（不再遠離濾紙）時，記為“躲避信號結束”，以此界定單次躲避行為的時間窗口。

關鍵量化指標：

僵住時間（Freezing time）：通過追蹤小鼠身體上16個特征點，將小鼠除呼吸外保持靜止超過3秒的時長定義為僵住時間，反映被動恐懼反應。

回避指數（Avoidance index）：用于標準化回避時間，計算公式為“回避指數=(P-50)/50”，其中P是小鼠在測試時間內（10分鐘）處于無濾紙區的時間占比（百分比），該指數可消除個體活動差異對結果的影響，更精準比較不同組小鼠的回避程度。

對照驗證：為排除氣味特異性干擾，采用相同方法測試小鼠對花生醬（偏好氣味）和2-庚酮（中性氣味）的反應，對比分析nTMT誘導行為的特殊性。

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嗅覺聯想記憶測試

（Olfactory associative memory test）

該測試用于評估對小鼠嗅覺聯想記憶的影響，核心是利用小鼠“氣味-食物”的先天聯想能力，通過三階段實驗量化記憶能力變化。

實驗設計邏輯：基于小鼠先天能通過氣味尋找食物的特性，通過“適應-訓練-回憶”三階段，觀察小鼠是否聯想記憶受損。

操作流程

適應階段（Habituation phase）：在40×40×30cm的開闊場中放置兩個相同物體，將小鼠從遠離物體的側邊中央放入，讓其適應環境10分鐘（第1天），消除對測試空間和物體的陌生感。

訓練階段（Training phase）：在兩個物體上分別放置相同奶酪（一個置于物體頂部，隱藏但可散發氣味；一個置于另一個物體后方），每天訓練小鼠10分鐘，持續6天，讓小鼠建立“特定物體位置-奶酪氣味”的聯想。

回憶階段（Recall phase）：第8天移除奶酪，進行行為測試，記錄小鼠到達“曾放置奶酪位置”的時間，該時間被定義為“潛伏期（Latency）”潛伏期越長，說明嗅覺聯想記憶越弱。

埋藏食物顆粒測試

（Buried food pellet test）

該測試用于評估小鼠的氣味檢測能力（反映嗅覺閾值）。

實驗準備

小鼠處理：實驗前將小鼠單獨飼養并禁食24小時，確保其有尋找食物的動機；

測試環境：在26×17×12cm的測試籠中鋪設3cm厚的墊料，實驗前讓小鼠在籠中適應10分鐘；

刺激物放置：將200mg食物顆粒埋在墊料下約0.5cm處，每次實驗隨機改變食物顆粒位置，并更換新鮮墊料，避免氣味殘留干擾。

行為記錄與對照驗證

核心指標：記錄小鼠從放入籠中到用前爪發現并抓取食物顆粒的時間，即“尋食潛伏期”。潛伏期越長，說明氣味檢測能力越弱（嗅覺閾值越高）。

對照實驗：為排除“運動能力或尋食動機變化”對結果的干擾，在埋藏食物顆粒測試后進行“視覺食物顆粒測試”：將食物顆粒放在墊料表面，觀察小鼠的尋食潛伏期，若兩組（對照組vs實驗組）無差異，則證明運動能力和動機正常，僅嗅覺檢測能力可能存在差異。

Fig1小鼠對捕食者氣味（nTMT）的行為反應

呈現了小鼠在nTMT刺激下的行為表現。A、D圖是實驗場景，B、C、E圖通過距離、速度等指標，展示小鼠在nTMT存在時會產生遠離刺激源等回避行為，還會出現僵住（Freezing）狀態，體現出對捕食者氣味的先天恐懼反應。

實驗場景使用了3D運動捕捉和3D重建技術（3D motion-capture and 3D reconstruction）。具體來說，在一個圓形開闊場（高度40cm，直徑50cm）中，在場地的四個角落配備了四臺高清數字相機，以30幀每秒的速度記錄小鼠的行為。通過這些相機捕捉小鼠在場地中的運動信息，進而利用相關技術實現對小鼠行為的3D重建，以便后續精確分析小鼠在面對刺激（如捕食者氣味nTMT）時的行為表現，例如移動軌跡、與刺激源的距離等。

這種方法可以較為精準地追蹤小鼠的行為變化，為研究小鼠對捕食者氣味的回避和躲避等行為提供詳細的數據支持。

總結

從行為角度深入理解動物對捕食者氣味的反應機制，為進一步研究人類恐懼相關行為（如焦慮癥、創傷后應激障礙等精神疾病中出現的恐懼反應異常）的神經基礎提供參考，為相關疾病的干預提供潛在靶點和治療思路。

文獻引用：

• Xu H, Yuan H, Song H, Pan Y, Wu Z, Wang S, Cheng J, Luo Y, Lin L, Min P, Yue Y, Chen X, Zhang K, Fukunaga K, Sasaki T, Mao X, Han F, Lu YM. Multimode neural population coding of diverse innate fear response by mitral and tufted cells. Cell Rep. 2025 Sep 8;44(9):116255. doi: 10.1016/j.celrep.2025.116255. Epub ahead of print. PMID: 40924580.

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