單B細(xì)胞篩選：傳染病抗體研發(fā)的"加速器"

摘要：單克隆抗體已成為治療傳染病的核心武器。從1975年雜交瘤技術(shù)誕生到如今的微流控和高通量測(cè)序技術(shù)，抗體發(fā)現(xiàn)方法經(jīng)歷了翻天覆地的變化。本文將帶你了解傳統(tǒng)與新興的單B細(xì)胞篩選技術(shù)，看看它們?nèi)绾卧谛鹿谝咔橹写蠓女惒剩约拔磥?lái)抗體研發(fā)的發(fā)展方向。

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一、為什么我們需要快速發(fā)現(xiàn)抗體？

傳染病始終威脅著人類健康。新冠疫情、HIV、萊姆病等疾病不斷出現(xiàn)，給全球公共衛(wèi)生帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。人體自身的抗體是對(duì)抗病原體的第一道防線，但有時(shí)免疫反應(yīng)不足以應(yīng)對(duì)嚴(yán)重感染。

免疫功能低下的人群尤其脆弱。他們的抗體產(chǎn)生能力較弱，更容易發(fā)展為重癥。即使是健康人，面對(duì)高載量病原體或免疫優(yōu)勢(shì)表位誘導(dǎo)的非中和抗體，也可能出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀。

單克隆抗體能精準(zhǔn)識(shí)別并中和病原體。它可以快速為患者提供被動(dòng)免疫，彌補(bǔ)自身免疫系統(tǒng)的不足。因此，快速高效地發(fā)現(xiàn)治療性抗體，成為應(yīng)對(duì)突發(fā)傳染病的關(guān)鍵。

二、傳統(tǒng)抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)：經(jīng)典但有局限

雜交瘤技術(shù)是抗體發(fā)現(xiàn)的"鼻祖"。1975年由Milstein和Kohler發(fā)明，1984年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。它通過(guò)將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得能無(wú)限分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

這項(xiàng)技術(shù)保留了天然的VH/VL配對(duì)，可靠性極高。目前已有數(shù)十種雜交瘤來(lái)源的抗體獲得FDA批準(zhǔn)。但它的細(xì)胞融合效率極低，大約每10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)能形成有活性的雜交瘤。

傳統(tǒng)單B細(xì)胞篩選是雜交瘤技術(shù)的重要替代方案。它通過(guò)FACS將單個(gè)B細(xì)胞分選到孔中，然后用RT-PCR擴(kuò)增抗體基因，再進(jìn)行重組表達(dá)和功能驗(yàn)證。

這種方法避開(kāi)了細(xì)胞融合的瓶頸，效率更高，耗時(shí)更短。它同樣保留了天然的VH/VL配對(duì)，已成功用于分離HIV、RSV等多種病毒的中和抗體。

表面展示技術(shù)也是常用的抗體發(fā)現(xiàn)方法。它將抗體庫(kù)展示在噬菌體或酵母表面，通過(guò)多輪篩選獲得高親和力抗體。阿達(dá)木單抗等重磅藥物就是通過(guò)這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)的。

圖1 傳統(tǒng)抗體發(fā)現(xiàn)方法概述

三、新興技術(shù)：讓抗體發(fā)現(xiàn)快10倍

LIBRA-seq是近年來(lái)最具革命性的技術(shù)之一。它將單細(xì)胞測(cè)序與DNA條形碼技術(shù)結(jié)合，能同時(shí)測(cè)定數(shù)千個(gè)B細(xì)胞的BCR序列和抗原特異性。

研究人員只需將B細(xì)胞與多種帶條形碼的抗原共同孵育，然后通過(guò)NGS測(cè)序，就能一次性獲得所有B細(xì)胞的抗體序列和它們識(shí)別的抗原信息。這大大提高了篩選通量。

LIBRA-seq已成功用于發(fā)現(xiàn)廣譜中和抗體。研究人員用它從HIV感染者體內(nèi)分離出能識(shí)別多種病毒株的抗體，還發(fā)現(xiàn)了能同時(shí)中和HIV和HCV的交叉反應(yīng)抗體。

NanoPen技術(shù)（如Beacon平臺(tái)）是另一項(xiàng)顛覆性技術(shù)。它利用光流體技術(shù)，將單個(gè)B細(xì)胞引導(dǎo)到納米級(jí)的小室中進(jìn)行培養(yǎng)和分析。

每個(gè)NanoPen的體積只有幾納升，比標(biāo)準(zhǔn)微孔小10萬(wàn)倍。研究人員可以在幾天內(nèi)完成從B細(xì)胞分離到抗體功能驗(yàn)證的全過(guò)程，而傳統(tǒng)方法需要數(shù)周。

Beacon平臺(tái)能同時(shí)檢測(cè)抗體的結(jié)合活性、配體阻斷能力和分泌滴度。它已廣泛應(yīng)用于新冠抗體、重鏈抗體和抗獨(dú)特型抗體的發(fā)現(xiàn)。

圖2 先進(jìn)的B細(xì)胞篩選方法

四、新冠疫情：抗體技術(shù)的"大考"與飛躍

新冠疫情是對(duì)抗體研發(fā)技術(shù)的一次全面檢驗(yàn)。單B細(xì)胞篩選技術(shù)在這場(chǎng)"大考"中表現(xiàn)出色，多個(gè)治療性抗體在短短幾個(gè)月內(nèi)就被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

貝替洛維單抗和巴尼韋單抗就是通過(guò)單B細(xì)胞篩選發(fā)現(xiàn)的。它們能阻斷S蛋白與ACE2受體的結(jié)合，對(duì)新冠病毒原始株和多種變異株都有很強(qiáng)的中和活性。

索托維單抗的發(fā)現(xiàn)更具傳奇色彩。研究人員從2004年感染SARS的患者體內(nèi)篩選記憶B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了能同時(shí)中和SARS和新冠病毒的抗體。這為應(yīng)對(duì)未來(lái)可能出現(xiàn)的冠狀病毒提供了新思路。

五、未來(lái)：抗體發(fā)現(xiàn)還能怎么變？

盡管新興技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，但它們的普及速度仍然較慢。這主要是因?yàn)?strong>LIBRA-seq和Beacon平臺(tái)需要昂貴的專業(yè)設(shè)備，而傳統(tǒng)方法簡(jiǎn)單易得，仍被廣泛使用。

未來(lái)的發(fā)展方向之一是將功能篩選整合到早期階段。目前的技術(shù)主要篩選抗體的結(jié)合活性，而直接篩選中和活性、穩(wěn)定性等藥物樣特性，將進(jìn)一步提高研發(fā)效率。

機(jī)器學(xué)習(xí)也將在抗體發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。利用LIBRA-seq產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)訓(xùn)練模型，可以預(yù)測(cè)抗體的抗原特異性和功能，大大加速研發(fā)進(jìn)程。

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們有理由相信，未來(lái)面對(duì)任何突發(fā)傳染病，都能在幾周內(nèi)找到有效的治療性抗體，為人類健康保駕護(hù)航。