《食品科學》：蘭州理工大學楊淑紅副教授等：牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的篩選及對肝細胞氧化應激損傷的保護作用

我國是肝臟疾病高負擔國家，現(xiàn)有約7 500萬慢性乙型肝炎患者及1 000萬丙型肝炎患者。同時，受環(huán)境變遷、生活方式轉(zhuǎn)變及飲食結(jié)構(gòu)改變等因素影響，非病毒性肝?。ㄈ缇凭愿尾　⒎蔷凭灾拘愿尾『退幬镄愿螕p傷）發(fā)病率持續(xù)攀升，嚴重威脅國民健康。

肝臟作為核心代謝的器官，在代謝廢物和毒素降解過程中會大量產(chǎn)生超氧陰離子自由基、過氧化氫以及羥自由基等活性氧（ROS），這些物質(zhì)主要來源于線粒體電子傳遞鏈、細胞色素P450及NADPH氧化酶系統(tǒng)。在正常生理條件下，這些ROS分子參與調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導和代謝過程；然而在病理狀態(tài)下，ROS過度累積會引發(fā)氧化應激，導致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA損傷，進而驅(qū)動肝損傷進展。

大量研究表明，補充高效天然抗氧化劑可有效清除自由基、調(diào)節(jié)氧化還原平衡，對疾病預防與健康提升具有重要意義。其中，食源性蛋白肽因具備易吸收、低致敏性和多樣生物活性等特點，已成為功能性食品開發(fā)的理想組分。目前，多種動植物（如魚類、乳類、亞麻籽等）來源的抗氧化肽已在食品與藥品領域廣泛應用。牦牛乳作為高營養(yǎng)價值乳源，其必需氨基酸與非必需氨基酸的組成比例均明顯優(yōu)于普通畜乳。酪蛋白約占牦牛乳總蛋白的80%，除具備卓越的乳化穩(wěn)定性和起泡特性外，還因其獨特的酶解敏感性，可通過蛋白水解作用釋放多種功能活性肽段，包括阿片肽、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽、免疫調(diào)節(jié)肽及抗氧化肽等，展現(xiàn)出治療潛力。

盡管一些研究已證實，牦牛乳酪蛋白酶解多肽具有顯著的化學抗氧化能力及對非肝細胞模型（巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞）的保護作用，但其能否直接保護肝細胞抵御氧化應激損傷仍缺乏實驗證據(jù)。這一關鍵問題嚴重限制了酪蛋白肽在肝病干預中的應用轉(zhuǎn)化。因此，蘭州理工大學生命科學與工程學院的楊淑紅、李敏倩、邊亞琴等采用單酶/復酶組合策略酶解牦牛乳酪蛋白獲得不同酶解多肽溶液，以2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）陽離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力及AML12小鼠肝實質(zhì)細胞氧化應激損傷細胞存活率為初篩指標，優(yōu)選抗氧化活性多肽；通過DEAE-52纖維素柱層析與Sephadex G50凝膠層析分級純化抗氧化多肽組分；系統(tǒng)評價多肽組分對AML12細胞內(nèi)ROS、過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）、NO及炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）分泌的調(diào)控效應，以期揭示酪蛋白酶解多肽對肝細胞氧化損傷的直接保護機制，為其在肝病治療產(chǎn)品開發(fā)中的轉(zhuǎn)化應用提供理論支撐。

1

酪蛋白酶解多肽自由基清除能力分析

選用5 種蛋白酶進行排列組合進行酶解，由于中性蛋白酶與堿性蛋白酶均能夠水解疏水性氨基酸，且中性蛋白酶酶解位點更廣泛，幾乎覆蓋堿性酶所有位點，因此在雙酶和三酶組合時剔除了包含堿性蛋白酶的組合，按照蛋白酶酶解活性的最佳pH值從高到低的順序進行酶解，共得到15 種酶解多肽。單酶酶解多肽分別為中性蛋白酶解多肽、木瓜蛋白酶解多肽、堿性蛋白酶解多肽、胃蛋白酶解多肽、胰蛋白酶解多肽；復合雙酶酶解多肽有6 種：中木雙酶解多肽、木胃雙酶解多肽、中胃雙酶解多肽、胰胃雙酶解多肽、胰木雙酶解多肽、胰中雙酶解多肽；復合三酶酶解多肽有4 種：胰木胃三酶解多肽、中木胃三酶解多肽、胰中胃三酶解多肽、胰中木三酶解多肽。

將不同種類的酪蛋白酶解多肽樣品用水稀釋20 倍，采用DPPH法與ABTS法測定各多肽樣品的自由基清除能力。如表2所示，胰木胃三酶解多肽的DPPH自由基清除率最高，為（42.50±2.48）%，其ABTS陽離子自由基清除率為（84.62±5.99）%；而中胃雙酶解多肽的自由基清除率總體最低，分別為（21.97±0.60）%、（38.94±5.13）%。相比于單一蛋白酶解產(chǎn)物，混合酶解酪蛋白多肽的自由基清除能力普遍升高，這與已有報道一致。實驗數(shù)據(jù)表明，中性蛋白酶解多肽的ABTS陽離子自由基清除能力較高，推測可能是中性蛋白酶的切割位點為苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸的氨基端或羧基端肽鍵，會釋放出大量疏水性氨基酸的短肽，這些短肽富含強大的電子供體和氫供體，可以有效清除ABTS陽離子自由基，因此具有較高的抗氧化活性。

2

酪蛋白酶解多肽對AML12細胞氧化應激損傷的保護作用

細胞活性水平可以直觀反映細胞的生理狀態(tài)，因此，通過測定氧化應激條件下AML12肝細胞的存活率，進而評價多肽的潛在保護作用。H2O2能夠直接氧化生物大分子（如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)），促進自由基的大量積累，進而引發(fā)細胞損傷甚至死亡。因此，選用H2O2建立AML12細胞氧化應激損傷模型。如圖1所示，H2O2氧化損傷AML12細胞的IC50為387 μmol/L。與氧化損傷組相比，谷胱甘肽組細胞存活率提高了83.48%，中性單酶解、胰木雙酶解和胰中胃三酶解多肽組（均稀釋至20 倍）的細胞存活率分別顯著提高至69.38%（P＜0.000 1）、65.95%（P＜0.000 1）、63.32%（P＜0.01）。因此選擇中性單酶解、胰木雙酶解和胰中胃三酶解多肽進行后續(xù)實驗。

3

DEAE-52纖維素柱層析分離多肽組分的抗氧化應激損傷能力

DEAE-52纖維素柱色譜法主要用于分離純化多糖，多肽，核苷酸和酶。經(jīng)過酶解的酪蛋白多肽因為含有不同電荷，可以與DEAE-52纖維素交換材料相互作用而被交換吸附，再被不同濃度的NaCl溶液洗脫，從而達到分離的目的。如圖2A～C所示，經(jīng)不同濃度NaCl溶液洗脫得中性單酶解多肽含有4 個組分，按洗脫順序命名為Z1、Z2、Z3和Z4；胰木雙酶解多肽有3 個組分，按洗脫順序命名為YM1、YM2和YM3；胰中胃三酶解多肽有3 個組分，按洗脫順序命名為YZW1、YZW2和YZW3。

將分離得到的10 個多肽組分經(jīng)過透析除鹽、冷凍干燥后配制成不同質(zhì)量濃度的水溶液，利用MTT法檢測AML12細胞毒性作用，如圖2D、E所示，50～200 μg/mL多肽水溶液對細胞無明顯毒性。因此，選取200 μg/mL進行AML12細胞氧化應激損傷實驗。如圖2F所示，與氧化損傷組相比，中性單酶解多肽Z1、Z2、Z3和Z4分離組分均表現(xiàn)出明顯的抗氧化應激損傷作用，其中Z3的保護作用最強，其細胞存活率達到83.32%。胰木雙酶解多肽YM1和YM2分離組分對AML12細胞無抗氧化應激損傷作用，而YM3表現(xiàn)出明顯的抗氧化應激損傷作用，其細胞存活率達72.31%。胰中胃三酶解多肽YZW1和YZW3組分也表現(xiàn)出顯著的抗氧化應激損傷作用，其細胞存活率分別為76.33%和77.18%。

4

Sephadex G-50凝膠層析分離多肽組分的抗氧化應激損傷能力

基于分子質(zhì)量差異選用Sephadex G-50凝膠層析對樣品進行分離，進一步純化具有抗氧化活性的多肽組分。如圖3A～G所示，Z1分離得到3 種組分，按洗脫順序命名為Z1-A、Z1-B和Z1-C；Z2分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為Z2-A和Z2-B；Z3分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為Z3-A和Z3-B；Z4分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為Z4-A和Z4-B；YM3分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為YM3-A和YM3-B；YZW1分離得到3 種組分，按洗脫順序命名為YZW1-A、YZW1-B和YZW1-C；YZW3分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為YZW3-A和YZW3-B。

將Sephadex G-50凝膠層析分離所得的多肽組分經(jīng)冷凍干燥后配制成不同質(zhì)量濃度的水溶液，采用MTT法檢測AML12細胞毒性作用。如圖3H、I所示，25～100 μg/mL多肽溶液對細胞無明顯毒性。因此，選取100 μg/mL進行AML12細胞氧化應激損傷實驗。如圖3J所示，與氧化損傷組相比，Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B和YZW3-B共5 種多肽組分表現(xiàn)出極其顯著的抗氧化應激損傷作用（ P ＜0.000 1），其細胞活力分別為72.20%、74.45%、74.60%、75.11%、82.19%。

5

酪蛋白抗氧化肽對AML12細胞MDA、NO、IL-1β及TNF-α水平的影響

為闡明酪蛋白衍生抗氧化肽對H 2 O 2 所致AML12細胞損傷的保護機制是否涉及ROS調(diào)控，本研究通過DCFHDA熒光標記技術定量分析細胞內(nèi)ROS含量變化。當ROS過量積累時，細胞的抗氧化系統(tǒng)無法有效調(diào)節(jié)，進而誘發(fā)氧化應激，造成顯著的氧化性細胞損傷 。DCFH-DA本身不具備熒光特性，經(jīng)細胞內(nèi)水解酶作用生成二氯二氫熒光素后，可被ROS氧化為熒光物質(zhì)二氯熒光素，進而會發(fā)出綠色熒光 。如圖4所示，空白對照組細胞ROS含量很低，加入H 2 O 2 后AML12細胞產(chǎn)生了大量的ROS，再加入Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B、YZW3-B抗氧化多肽組分后，細胞內(nèi)綠色熒光強度出現(xiàn)不同程度的減弱（ P ＜0.05、 P ＜0.01、 P ＜0.000 1），說明這些多肽組分能夠顯著降低細胞中的ROS含量。

6

酪蛋白抗氧化肽對AML12細胞MDA、NO、IL-1β及TNF-α水平的影響

MDA作為脂質(zhì)過氧化的標志性產(chǎn)物，其過量蓄積會破壞由磷脂雙分子層和膜蛋白構(gòu)成的生物膜系統(tǒng)，最終導致細胞膜通透性改變和結(jié)構(gòu)完整性喪失。因此，檢測MDA水平可以評估機體脂質(zhì)過氧化的程度，進而間接反映細胞的氧化應激損傷程度。將Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B和YZW3-B抗氧化多肽分別與AML12細胞共同培養(yǎng)，收集細胞進行脂質(zhì)過氧化物含量測定，結(jié)果如圖5A所示。與空白對照組相比，5 種抗氧化多肽組分都能顯著降低AML12細胞的MDA濃度（P＜0.01、P＜0.000 1）。

炎癥是機體針對病原體、理化刺激或組織損傷所觸發(fā)的一種免疫防御反應。當細胞內(nèi)ROS水平升高時，會激活炎癥信號通路，促使受損細胞大量分泌促炎介質(zhì)（如NO、TNF-α和IL-1β等），引起周圍細胞的炎癥反應，進一步導致組織損傷 。因此，通過測定細胞培養(yǎng)上清液的促炎介質(zhì)和炎癥因子表達水平，能夠有效評估細胞的炎癥反應程度。如圖5B～D所示，H 2 O 2 處理AML12細胞后其培養(yǎng)液中NO、TNF-α和IL-1β水平急劇升高，說明H 2 O 2 誘發(fā)了AML12細胞的炎癥反應，加入多肽組分后，NO、TNF-α和IL-1β水平均出現(xiàn)明顯下降。綜上，酪蛋白抗氧化多肽能夠抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和炎癥發(fā)生標志物NO的表達，改善H 2 O 2 誘導AML12細胞的炎癥反應。

結(jié) 論

本研究聚焦牦牛乳酪蛋白酶解多肽的抗肝細胞氧化應激損傷作用，通過系統(tǒng)分析不同酶解產(chǎn)物的自由基清除能力及對H2O2誘導AML12肝實質(zhì)細胞應激損傷的保護效應，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶解、胰木雙酶解及胰中胃三酶解多肽溶液（20 倍稀釋）不僅能夠顯著清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基，且在H2O2刺激下能將AML12細胞活力分別提升至69.38%、65.95%與63.32%。經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析與Sephadex G-50凝膠層析分級純化，篩選出5 種高效抗氧化多肽組分：Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B及YZW3-B。通過熒光顯微成像及ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)上述5 種多肽組分可明顯降低肝細胞氧化損傷標志物（ROS、MDA及NO）和炎癥因子（TNF-α、IL-1β）水平，證明牦牛乳酪蛋白多肽通過雙重調(diào)控氧化應激與炎癥信號，展現(xiàn)出顯著的肝細胞保護活性。本研究系統(tǒng)揭示了牦牛乳酪蛋白酶解多肽抗肝細胞氧化應激損傷的作用機制，可為開發(fā)靶向肝病干預的牦牛乳多肽功能食品提供理論支撐，對推動牦牛乳資源高值化利用具有實踐意義。

引文格式：

楊淑紅, 李敏倩, 邊亞琴, 等. 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的篩選及對肝細胞氧化應激損傷的保護作用[J]. 食品科學, 2026, 47(2): 104-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250715-119.

YANG Shuhong, LI Minqian, BIAN Yaqin, et al. Screening of antioxidant peptides from yak milk casein and their protective effects against oxidative stress injury in hepatocytes[J]. Food Science, 2026, 47(2): 104-112. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250715-119.

實習編輯：南伊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

為匯聚全球智慧共探產(chǎn)業(yè)變革方向，搭建跨學科、跨國界的協(xié)同創(chuàng)新平臺，由北京食品科學研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監(jiān)督管理總局技術創(chuàng)新中心（動物替代蛋白）、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，西南大學、 重慶市農(nóng)業(yè)科學院、 重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)技術創(chuàng)新聯(lián)盟、重慶工商大學、 重慶三峽科技大學 、西華大學、成都大學、四川旅游學院、北京聯(lián)合大學、 中國-匈牙利食品科學“一帶一路”聯(lián)合實驗室（籌）、 普洱學院 共同主辦 的“ 第三屆大食物觀·未來食品科技創(chuàng)新國際研討會 ”， 將于2026年4月25-26日 （4月24日全天報到） 在中國 重慶召開。

長按或微信掃碼進行注冊

為系統(tǒng)提升我國食品營養(yǎng)與安全的科技創(chuàng)新策源能力，加速科技成果向現(xiàn)實生產(chǎn)力轉(zhuǎn)化，推動食品產(chǎn)業(yè)向綠色化、智能化、高端化轉(zhuǎn)型升級，由北京食品科學研究院、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，合肥工業(yè)大學、安徽農(nóng)業(yè)大學、安徽省食品行業(yè)協(xié)會、安徽大學、合肥大學、合肥師范學院、北京工商大學、中國科技大學附屬第一醫(yī)院臨床營養(yǎng)科、安徽糧食工程職業(yè)學院、安徽省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所、安徽科技學院、皖西學院、黃山學院、滁州學院、蚌埠學院共同主辦的“第六屆食品科學與人類健康國際研討會”，將于 2026年8月15-16日（8月14日全天報到）在中國 安徽 合肥召開。

長按或微信掃碼進行注冊

會議招商招展

聯(lián)系人：楊紅；電話：010-83152138；手機：13522179918（微信同號）