Cell?|?線粒體通過SLC25A35驅動甘油脂合成

撰文 | 阿童木

線粒體不僅是細胞的“能量工廠”，也是連接糖代謝、脂質合成與信號轉導的代謝樞紐，持續向細胞核、內質網及脂滴等區室輸送 ATP 及關鍵代謝中間體。其中，磷酸烯醇丙酮酸（PEP）是一種具有高磷酸轉移勢的核心代謝節點，既參與糖酵解中 ATP 的生成，也在糖異生、甘油異生以及免疫細胞 Ca2 ? 信號調控等過程中發揮重要作用。因此， PEP 在細胞中的生成位置及其跨區室轉運方式，直接決定了碳流如何在不同代謝路徑之間分配，從而影響細胞對能量與物質的調控能力【1】。

PEP可由丙酮酸經“ 丙酮酸—草酰乙酸—PEP ”旁路再生：丙酮酸首先由丙酮酸羧化酶轉化為草酰乙酸（OAA），隨后由PEP羧激酶（PEPCK）催化生成PEP。長期以來，這一過程被認為主要發生在胞質中，這一認識很大程度上來源于對肝臟糖異生中胞質型PEPCK（PCK1）的研究【2】。然而，近年來的代謝示蹤研究逐漸改變了這一觀點。在脂肪細胞中，來自丙酮酸的M+3 PEP主要來源于線粒體，提示線粒體本身是PEP的重要生成場所【3】。從路徑上看，在線粒體中直接生成PEP可減少跨區室代謝轉換步驟。

這些結果共同指向一個關鍵“斷點”：線粒體內生成的PEP并不能自由跨膜。那么，這部分代謝中間體究竟如何被輸出到胞質，并進一步參與脂質合成等代謝過程？這一問題長期缺乏直接分子機制解釋。

近日，哈佛大學 Shingo Kajimura 團隊 等在 Cell 雜志發表了題為 Mitochondrial control of glycerolipid synthesis by a PEP shuttle 的研究文章， 鑒定出線粒體載體蛋白SLC25A35是介導PEP跨線粒體內膜輸出的關鍵轉運蛋白。研究表明，線粒體通過PCK2將丙酮酸轉化為PEP，并通過SLC25A35輸出至胞質，為甘油異生提供碳源，從而驅動甘油-3-磷酸及甘油脂的合成 。該研究提出“ PEP shuttle ”這一新的代謝通路概念，將線粒體代謝與脂質合成直接連接起來。

在脂肪細胞中，作者首先比較了兩種PEPCK同工酶的作用，發現PCK2而非PCK1是主要功能來源。通過CRISPR-Cas9敲除和放射性及穩定同位素示蹤實驗，PCK2缺失顯著抑制脂肪細胞中甘油脂的合成，而PCK1缺失影響較小，提示 線粒體來源的PEP在脂質合成中占據主導地位 。這一結果從源頭上確立了 “線粒體PEP”作為脂質合成主要碳源 的地位。

為進一步尋找負責PEP輸出的線粒體轉運蛋白，作者在SLC25載體蛋白家族中進行了系統篩選，并設定了三項功能性標準：在脂肪細胞中富集表達、與脂質合成相關基因呈正相關、并可被脂質生成信號誘導。基于這一篩選邏輯，最終鎖定此前功能未知的載體蛋白SLC25A35。通過亞細胞定位實驗結合高分辨率顯微成像及蛋白酶保護分析，作者證實 SLC25A35 蛋白定位于線粒體內膜 ，符合其作為代謝物跨膜轉運體的特征。

作者接下來對SLC25A35進行了功能驗證，通過 Easi-CRISPR 構建 Slc25a35 敲除的前脂肪細胞，并利用 Mito-Tag 技術分離線粒體進行代謝組學分析。結果顯示， 敲除 SLC25A35 后，線粒體內 PEP 顯著積累，而全細胞 PEP 水平變化不明顯，提示 PEP 被滯留在線粒體中，無法有效輸出 。13 C ? - 丙酮酸示蹤進一步表明，這些 積累的 PEP 主要來源于丙酮酸經 OAA 生成的旁路 ，而非 TCA 循環氧化途徑。同時， TCA 循環活性及相關關鍵酶表達未發生明顯變化，說明該效應具有較高的代謝特異性。

為了直接檢測PEP跨膜運輸，作者建立了線粒體輸出實驗體系。結果顯示，分離的野生型線粒體可隨時間向外釋放13C標記的PEP，而Slc25a35缺失顯著降低這一輸出能力，直接證實了 SLC25A35是線粒體PEP跨膜輸出所必需的轉運蛋白 。

在體外重建實驗中，作者利用純化的SLC25A35構建脂質體系統，進一步驗證其轉運功能。實驗表明，該蛋白能夠特異性轉運PEP，且該過程可被未標記PEP競爭抑制，顯示出明確的底物特異性。底物競爭實驗還發現，OAA、蘋果酸及琥珀酸可輕度抑制該轉運，而延胡索酸及支鏈酮酸類代謝物則無明顯影響，提示 SLC25A35對PEP具有較高選擇性 。此外，PEP轉運呈pH梯度依賴性，在低pH條件下增強，表明該過程依賴質子梯度驅動，與線粒體能量狀態密切相關。這些體外實驗證明 SLC25A35是一種以PEP為高親和力底物、受質子梯度驅動的線粒體轉運蛋白 。

在結構層面，由于缺乏實驗解析結構，研究者基于AlphaFold預測模型進行分子對接和動力學模擬分析。結果顯示，SLC25A35具有典型的六跨膜螺旋結構，其中央通道形成帶正電的結合腔，有利于結合帶負電的PEP分子。模擬分析顯示，PEP的磷酸基和羧基可與多個保守殘基形成穩定相互作用。突變實驗進一步驗證，Y124A和R175A單突變體保留野生型轉運活性，而雙突變體和三突變體反而轉運增強，這與SLC25家族載體中“漏門（ leaky gate ）”現象一致——關鍵殘基突變削弱鹽橋網絡、降低構象能壘，在底物充足條件下表現為轉運增強。這些結果從結構和功能層面驗證了 Y124、R175和R276等殘基是SLC25A35介導PEP轉運的關鍵位點 。

在代謝功能層面，SLC25A35直接決定甘油異生通量。13C示蹤結果顯示，敲除該基因后，脂肪細胞中GA3P/DHAP生成顯著減少，G3P水平下降，來自丙酮酸的碳流難以進入甘油骨架合成路徑。相應地，甘油三酯合成明顯受阻。值得注意的是，過表達胞質型PCK1無法恢復這一缺陷，且在SLC25A35缺失背景下進一步敲除PCK2不產生疊加效應，說明 甘油異生依賴于PCK2生成的線粒體PEP經SLC25A35輸出的特定途徑，而非總細胞PEP池 。

體內條件下，脂肪組織特異性敲除Slc25a35的小鼠在高脂飲食條件下體重增長減緩，白色和棕色脂肪組織質量下降，脂肪細胞體積減小，但能量消耗、食物攝入及產熱能力未見顯著變化。這表明 SLC25A35主要調控脂質儲存過程，而不直接影響整體能量代謝 。放射性示蹤實驗進一步顯示，敲除小鼠脂肪組織中甘油骨架的生成顯著減少，而脂肪酸部分未受影響，證明該通路特異作用于甘油異生。這些體內數據直接證明， SLC25A35介導的線粒體PEP輸出是脂肪組織甘油異生和甘油脂質合成的必要環節 。

在肝臟中，SLC25A35同樣具有重要作用。轉錄組分析顯示，該基因在脂肪性肝病患者及高脂飲食小鼠中表達上調。肝臟特異性敲除Slc25a35顯著降低肝臟甘油三酯含量和脂滴積累，并伴隨炎癥反應減弱及胰島素敏感性改善。進一步分析發現，該操作并不影響肝細胞的糖異生能力，提示 線粒體來源的PEP在肝臟中主要用于脂質合成而非葡萄糖生成 。

在治療層面，作者在肥胖模型中通過AAV遞送系統誘導敲除肝臟SLC25A35，結果顯示可顯著降低肝臟脂質積累、改善肝功能指標（ALT和AST），且未引發明顯的線粒體應激反應。這些結果提示， 靶向肝臟SLC25A35可有效緩解肥胖相關肝臟脂肪變性 。

綜上所述， 本研究鑒定了 線粒體PEP轉運蛋白SLC25A35，并提出“PEP shuttle”這一新的代謝通路模型：線粒體通過PCK2生成PEP，并將其輸出至胞質以支持甘油異生，從而驅動甘油脂合成。這一機制將線粒體代謝狀態與脂質合成能力直接耦聯，揭示了細胞通過跨膜代謝物運輸精細調控碳流分配的關鍵機制，也為代謝性疾病的干預提供了新的潛在靶點。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.02.017

制版人： 十一

參考文獻

1. Yu, S., et al. (2021). Phosphoenolpyruvate carboxykinase in cell metabolism: Roles and mechanisms beyond gluconeogenesis.Mol. Metab.53, 101257 .

2. Méndez-Lucas, A. et al. (2013) . PEPCK-M expression in mouse liver potentiates, not replaces, PEPCK-C mediated gluconeogenesis.J. Hepatol.59, 105–113.

3. Stark, R., et al. (2014). A role for mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-M) in the regulation of hepatic gluconeogenesis.J. Biol. Chem.289, 7257–7263.

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