貓傳染性腹膜炎病毒非結構蛋白14/16甲基轉移酶的突變減弱了病毒在貓體內的致病性

貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）可引起對貓科動物致命的免疫介導性疾病，但目前臨床上仍缺乏疫苗提供的有效保護。冠狀病毒非結構蛋白nsp14和nsp16的甲基轉移酶（MTase）活性會影響病毒毒力，但尚未有研究探討影響酶活的nsp14與nsp16突變對FIPV毒力的作用。本研究基于前期構建的感染性克隆QS-79，通過定點突變nsp14（N415）和nsp16（D129）的MTase活性位點，成功拯救出兩株分別命名為FIPV QS-79 dnsp14與dnsp16的突變毒株。突變株在體外表現出與親本毒株相似的合胞體形成能力和生長動力學特征，并在巨噬細胞系中顯著刺激干擾素及細胞因子表達上調。動物實驗顯示，dnsp14與dnsp16對貓的致病性顯著降低，死亡率較野生型毒株下降75%。以高劑量（105 TCID50）和低劑量（104 TCID50）對貓進行免疫接種時，dnsp14在兩種劑量下均能誘導高效價中和抗體（>1:156），而dnsp16僅能誘導低水平中和抗體（<1:64）；攻毒試驗中dnsp14在兩種免疫劑量下均可為50%的貓提供保護，而dnsp16未能提供有效保護。上述結果表明兩種突變株對貓的致病性均減弱，且dnsp14比dnsp16能誘導更好的體液免疫反應與保護效果。

結果

1、FIPV nsp14 N415和nsp16 D129是關鍵的MTase 活性位點

基于先前的研究，發現完全敲低nsp14或nsp16的MTase活性會導致病毒無法被拯救。為了制定獲得能在細胞中復制的重組突變FIPV的策略，我們通過序列比對分析了FIPV 79-1146、PEDV CV777、MHV A59、TGEV WH-1、SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1、SARS-CoV Tor2和MERS-CoV EMC。發現nsp14和nsp16的MTase活性位點在多種冠狀病毒中高度保守，最終確定nsp14第415位的天冬酰胺和nsp16第129位的天冬氨酸為突變靶點（圖1A）。通過AlphaFold2在線網站對FIPV QS-79親本株及dnsp14和dnsp16突變株進行了結構模擬，并使用AutoDock Vina預測了野生型和突變株的SAM結合口袋。如圖所示，分子對接表明，nsp14 N415位點的側鏈參與β-鏈的形成，并與鄰近的α-螺旋共同形成一個穩定帽核結構（GPPPA）和SAM的口袋，促進nsp14參與RNA帽添加的甲基轉移過程（圖1B）。當第415位的氨基酸突變為丙氨酸時，nsp14 415位點與鳥苷磷酸基團上的氧原子之間的氫鍵形成被破壞（圖1C）。nsp16的模擬結果顯示，第129位的天冬氨酸位于SAM結合口袋內更靠近m7G（cap-0結構）的位置，該位點與口袋內的其他氨基酸通過分子間相互作用來穩定SAM并將其朝向m7G定位（圖1D和E）。為了驗證這兩個位點對酶活性的影響，我們表達了FIPV QS-79 nsp16、nsp14、nsp10、nsp14 N415A位點突變和nsp16 D129A位點突變蛋白，然后使用相應的底物測量了MTase活性。結果顯示，nsp14 N415和nsp16 D129突變的甲基轉移酶活性大大降低（圖1F）。這些結果證明nsp14 N415位點和nsp16 D129位點是關鍵的MTase活性位點；同時，nsp14和nsp16參與了FIPV QS-79 RNA帽結構的甲基化。

2、突變FIPV毒株dnsp14和dnsp16的拯救

通過體外CRISPR-Cas9技術操作病毒基因組，以設計QS-79 nsp14和QS-79 nsp16酶活性缺失的重組突變體。首先，我們進行了sgRNA體外轉錄和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。片段大小正確，完整性和純度得到確認（圖2A）。使用Cas9酶和sgRNA消化QS-79 BAC質粒，成功產生線性化載體和包含目標基因的片段（圖2B）。通過融合PCR進行定點突變，成功產生了兩個基因片段，一個用于nsp14 N415A位點突變，一個用于nsp16 D129A位點突變（圖2C和D）。通過轉化將突變片段和BAC質粒進行重組結合，并對所得質粒進行測序。測序結果顯示，nsp14的第415位和nsp16的第129位均突變為編碼丙氨酸，表明dnsp14 BAC和dnsp16 BAC構建成功（圖2E）。將dnsp14 BAC、dnsp16 BAC和陽性對照QS-79 BAC通過轉染插入HEK-293T細胞，24小時后，用細胞上清液感染CRFK細胞36小時。進行了蛋白質印跡和間接免疫熒光實驗，并成功檢測到FIPV病毒N蛋白（圖2F和G），證明dnsp14和dnsp16突變株已在CRFK細胞中成功拯救。

3、dnsp14和dnsp16在體外未表現出增殖能力減弱但誘導增強的免疫反應

為了表征突變株dnsp14和dnsp16在體外的生物學特性，我們以0.01的感染復數（MOI）用dnsp14、dnsp16和QS-79感染CRFK和Fcwf-4細胞，并每12小時收集病毒細胞上清液進行TCID50測定。生長動力學曲線表明，突變株與親本株在感染兩種細胞系后，各時間點的增殖趨勢、病毒滴度和峰值病毒滴度均無顯著差異（圖3A和B）。病毒合胞體形成實驗也顯示，突變株與親本株感染的合胞體形成能力無顯著差異（圖3C）。以MOI為0.01的劑量感染Fcwf-4細胞并總共培養24小時，提取細胞RNA進行實時PCR檢測。結果顯示，dnsp14和dnsp16誘導了顯著更高水平的IFN-β和ISG15的mRNA表達（圖3D和E）。此外，觀察到感染dnsp16突變株的細胞中TNF-α的表達顯著增加，而dnsp14突變株與QS-79親本株感染后的TNF-α表達水平無顯著差異（圖3F）。這些結果表明，QS-79 nsp14 N415A位點突變和nsp16 D129A位點突變不影響病毒在體外的增殖能力，但重組病毒能誘導更強的免疫反應。

4、dnsp14和dnsp16在體內的致病性減弱

使用成年貓的口服攻毒模型來評估突變株的體內致病性（圖4A）。將十六只健康成年貓隨機分為四組，每組四只；三個實驗組中的貓分別口服接種1 mL 105.5 TCID50/mL的dnsp14、dnsp16和QS-79，模擬組貓口服接種1 mL無菌PBS。基于食欲、精神狀態、眼鼻分泌物、糞便排泄和神經系統癥狀進行臨床評分。實驗結果顯示，感染QS-79株的成年貓體溫升高和體重減輕，而dnsp14和dnsp16感染組的貓在整個試驗期間沒有出現持續性發熱（圖4B和C）。dnsp14組貓的體重在感染1周后輕微下降，并在后期逐漸恢復。dnsp16組貓的體重沒有下降，模擬組貓沒有出現體溫升高或體重減輕。QS-79組成年貓的臨床癥狀在感染后持續惡化，表現為精神抑郁、食欲不振、眼鼻有炎性分泌物以及排泄減少。dnsp14組貓表現出食欲不振、精神抑郁以及體重減輕，但這些臨床表現隨著體重的恢復而消失，其總體臨床評分顯著低于QS-79感染組貓；同時，dnsp16組貓的臨床癥狀與模擬組貓沒有差異，未發現明顯的FIP臨床癥狀（圖4D）。淋巴細胞減少是FIP的典型特征，血常規檢測結果顯示，QS-79感染組的淋巴細胞數量在1周后降至基線水平以下，而dnsp14和dnsp16感染組以及模擬組的淋巴細胞數量在整個試驗期間均在正常范圍內波動（圖4E）。中和抗體檢測結果顯示，感染QS-79、dnsp14和dnsp16的成年貓能誘導中和抗體水平升高。感染dnsp14誘導的抗體水平與QS-79感染無顯著差異，感染dnsp16誘導的抗體水平低于其他兩個實驗組，模擬組未產生中和抗體（圖4F）。檢測了先天免疫基因的表達，如IFN-β、ISG15和IFITM1，結果顯示與qs-79感染后的高表達相比，dnsp14和dnsp16感染降低了這些基因的表達（圖S1）。死亡率結果顯示，QS-79組的所有成年貓在9周內死亡，三只貓在感染后2周內死亡，最后一只死亡的貓病程較長，在感染后第59天死亡。dnsp14組的一只貓在攻毒后第36天死亡，dnsp16組的一只貓在攻毒后第44天死亡，模擬組無貓死亡（圖4G）。分別在第36天、第44天、第59天和第59天對dnsp14、dnsp16、QS-79和MOCK組進行解剖和病理學檢查。根據解剖和病理學檢查，QS-79組的肉眼病變明顯，在肝臟、腎臟和脾臟觀察到典型的FIP非干酪樣肉芽腫，dnsp14和dnsp16組出現纖維蛋白性漿膜炎和化膿性肉芽腫，腎臟無明顯病變，模擬組的肝臟、腎臟和脾臟無明顯病變（圖4I）。蘇木精-伊紅（H&E）染色顯示上述病變處有顯著的炎性細胞浸潤和細胞壞死，但dnsp14和dnsp16組的病變嚴重程度低于QS-79組，模擬組組織形態完整，無炎癥浸潤（圖4J）。免疫組化結果顯示，在QS-79感染貓的肝臟、脾臟和腎臟中檢測到FIPV N蛋白，證明QS-79感染貓的器官病變是由FIPV引起的。在dnsp14和dnsp16感染貓的肝臟和脾臟中也觀察到表明發病區域的棕色染色信號，腎臟無顯著陽性信號，模擬組任何貓均無陽性信號（圖4K）。組織器官病毒載量檢測顯示，dnsp16組的病毒載量顯著低于QS-79組和dnsp14組，僅在脾臟和肺部檢測到病毒顆粒（圖4H）。這些結果表明，兩種突變株在體內成功減毒。

5、降低免疫劑量降低了dnsp16免疫的死亡率但不影響dnsp14免疫

突變株在105.5 TCID50劑量下仍有25%的死亡率，因此通過降低免疫劑量盡可能提高突變株免疫的安全性。對于dnsp14和dnsp16突變株，設計了高劑量（105 TCID50）和低劑量（104 TCID50）免疫組，相應的貓通過兩次口服劑量和一次皮下注射進行免疫，每次間隔21天（圖5A）。對照組貓以相同方式免疫1 mL無菌PBS。結果顯示，dnsp14的死亡率不具劑量依賴性，在高劑量和低劑量免疫后均有三分之一的貓死亡（圖5B）。dnsp14突變株在高劑量免疫三次后，在所有貓中誘導了1:1024的中和抗體滴度。在低劑量免疫三次后，免疫貓的平均抗體滴度超過1:256，但有一只貓在三次免疫后未產生中和抗體（圖5D）。dnsp16突變株在高劑量下死亡率為25%，而在低劑量下免疫的貓100%存活（圖5C）。dnsp16突變株在兩種免疫劑量下誘導的中和抗體水平均低于dnsp14，并且低劑量免疫的貓中有一半未產生中和抗體（圖5E）。總之，盡管dnsp14突變株在高和低免疫劑量下均能誘導強烈的體液免疫反應并產生高水平中和抗體，但其免疫安全性仍需提高；低劑量免疫dnsp16突變株的成年貓存活率為100%，但該突變株在該劑量下誘導的體液免疫反應較弱，僅產生低水平中和抗體。

6、50%的貓在dnsp14免疫組中能夠抵抗高致病性毒株QS-79的攻毒

在首次免疫后第80天，所有貓均用1 mL 105.5 TCID50/mL QS-79進行攻毒試驗（每組n=4）。結果顯示，PBS免疫組、dnsp14高劑量免疫組和dnsp14低劑量免疫組的貓在感染后立即出現體溫升高和體重減輕的臨床癥狀，PBS組貓的臨床癥狀最嚴重，所有貓在感染期間均出現發熱（圖6A和B）。臨床評分結果顯示，PBS組中50%的貓在感染中期出現繼發性細菌感染，所有貓在死亡當天出現嚴重的FIP癥狀，包括呼吸窘迫和后肢癱瘓，而dnsp14免疫組的動物均出現較輕的癥狀，未出現神經系統癥狀或呼吸窘迫。dnsp14低劑量和高劑量免疫分別將成年貓的發病時間推遲了1周和2周（圖6C）。PBS組的所有貓在攻毒后49天內死亡，而所有dnsp14免疫組中50%的動物受到保護，免于高致病性毒株QS-79的侵害，除了低劑量組中一只未產生抗體的貓在攻毒后第10天死亡，其他dnsp14免疫的成年貓則表現出延長的存活期（圖6D）。血常規和生化分析顯示，所有免疫了dnsp14突變株的貓在攻毒后均表現出淋巴細胞水平的短暫下降，fSAA水平在攻毒后逐漸升高，其中低劑量免疫組在感染后恢復更快（圖6E）。淋巴細胞計數在攻毒后持續下降，fTBIL、fALT和fAST水平在攻毒后持續升高，fAST水平在感染第一周結束時遠高于正常范圍（圖6F至I）。dnsp14免疫組貓的fALT和fAST水平在攻毒后升高了3-4周，然后逐漸恢復正常。PBS組的生化和血常規檢測異常是不可逆的。對實驗組貓進行了病理學分析和病毒載量測量。解剖顯示，dnsp14免疫組貓在病毒攻毒后，腎臟出現典型的FIPV感染肉芽腫病變（白色箭頭所示），而其他器官的病變嚴重程度低于PBS免疫貓（圖6J）。通過H&E染色，在所有三個實驗組貓的肝臟、腎臟和脾臟中均觀察到顯著的炎性細胞浸潤。dnsp14高劑量免疫組貓在攻毒后肝臟未顯示顯著的FIP病變特征，但H&E染色顯示肝組織中出現肝細胞腫脹和胞質空泡化（圖6K）。免疫組化結果顯示，所有三個實驗組中肝臟、腎臟和脾臟的病理損傷均由FIPV感染引起（圖6L）。dnsp14高劑量免疫攻毒組和PBS免疫攻毒組的器官病毒載量顯著升高。dnsp14高劑量免疫攻毒組在盲腸、大腦和小腦中的病毒載量低于檢測限，在肝臟、脾臟、肺和淋巴結中的病毒載量較低（圖6M）。上述數據表明，dnsp14突變株可以誘導高水平的中和抗體并為成年貓提供部分保護。以不同免疫劑量施用dnsp14突變株在成年貓中提供了一致的保護，50%的成年貓能抵抗高致病性毒株QS-79，而死亡的50%的貓其由FIPV感染引起的臨床表現和病理損傷得到緩解，并且存活期延長。

7.不同劑量的dnsp16均不能防御FIPV QS-79的攻毒

在首次免疫后第80天，所有貓均用1 mL 105.5 TCID50/mL QS-79進行攻毒試驗。結果顯示，不同劑量dnsp16免疫在注射后立即引起體溫升高和持續性發熱，貓的體重在1個月內降至其初始體重的80%（圖7A和B）。食欲不振、抑郁、呼吸困難和共濟失調等臨床癥狀與PBS免疫組無顯著差異，臨床評分在1個月內持續增加（圖7C）。高劑量免疫組和低劑量免疫組的貓均在30天內自然死亡（圖7D）。三個實驗組之間的死亡率或死亡時間無顯著差異。所有三個實驗組的貓在攻毒后均顯示淋巴細胞水平下降，兩個dnsp16免疫組的貓下降速度比PBS組慢。并且fSAA、fTBIL、fALT和fAST水平在感染QS-79后持續升高（圖7E至I）。對死亡貓的病理剖檢顯示，dnsp16免疫后攻毒引起的器官病變非常明顯，肝臟、腎臟和脾臟出現典型的FIP肉芽腫病變（圖7J）。低劑量dnsp16免疫后的攻毒組肝臟和腎臟病變最為明顯，病變部位的H&E染色顯示所有組織均出現嚴重的病理病變。肉芽腫以壞死組織為中心，周圍結締組織有大量炎癥浸潤（圖7K）。此外，對病變部位進行了免疫組化檢測，所有切片均顯示強陽性信號（圖7L）。病毒載量評估顯示，與PBS免疫組相比，免疫了dnsp16突變株的成年貓在肝臟、脾臟、肺、腎臟、淋巴結、盲腸和大網膜中的病毒水平更高（圖7M）。不同dnsp16免疫劑量的攻毒保護實驗結果表明，低水平的中和抗體無法阻斷FIPV感染。攻毒后更高的臨床評分、更明顯的器官病變和更高的病毒載量表明，dnsp16疫苗接種可能誘導成年貓的疾病增強。

結論

本研究成功構建并拯救了在nsp14 N7-MTase活性位點（N415）和nsp16 2'-O-MTase活性位點（D129）發生突變的FIPV毒株。突變株dnsp14和dnsp16在成年貓體內的致病性均較低，其中dnsp16更不穩定。dnsp14在免疫后誘導高水平中和抗體的產生，并能針對強毒FIPV攻毒提供50%的保護，而dnsp16在免疫后僅誘導低水平中和抗體的產生，并且不能防御FIPV攻毒。本研究成功構建了一種減毒、能在宿主體內有效復制并能提供部分保護以抵抗強毒親本病毒的候選疫苗，為開發針對貓冠狀病毒nsp14/nsp16 MTase的減毒活疫苗提供了參考。

來源：微生物前沿

編輯：吃一口小貓