Cell Stem Cell?|?3D打印“細(xì)胞小屋”助力體外培養(yǎng)工程化造血干細(xì)胞

撰文|亦

以患者自身的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC） 作為“治療對象”和“治療載體”的基因治療方法為多種遺傳性血液疾病提供了“一次性治愈”的希望【1-2】。然而，在體外培養(yǎng)和基因編輯過程中，HSPCs常會(huì)遭遇DNA損傷、氧化應(yīng)激、過早分化等功能喪失問題，這嚴(yán)重影響了治療的安全性與長期效果【3-5】。傳統(tǒng)的二維（2D）培養(yǎng)系統(tǒng)無法模擬體內(nèi)骨髓微環(huán)境的機(jī)械與結(jié)構(gòu)支持，導(dǎo)致干細(xì)胞功能在體外迅速下降。

近日，意大利米蘭圣拉斐爾科學(xué)研究所Raffaella Di Micco團(tuán)隊(duì)在Cell Stem Cell上發(fā)表題為Nanoengineered 3D culture substrate enables superior persistence and polyclonal engraftment of genetically engineered hematopoietic stem cells的文章。提出 使用一種名為 “nichoids” 的納米工程化3D培養(yǎng)基底，為HSPCs提供類似體內(nèi)的機(jī)械支持，旨在減少培養(yǎng)引起的應(yīng)激反應(yīng)，維持干細(xì)胞特性，并提高基因編輯后的植入效率 。

研究團(tuán)隊(duì) 設(shè)計(jì)的 n ichoids是一種通過高精度雙光子激光3D打印技術(shù)，使用生物相容性樹脂（SZ2080）在玻璃片上制造的、具有規(guī)則微觀架構(gòu)的剛性人工三維支架，專門設(shè)計(jì)用于在體外培養(yǎng)中模擬和支持細(xì)胞的生長與功能 。為了驗(yàn)證nichoids能否在體外培養(yǎng)期間為造血干細(xì)胞提供機(jī)械支持，從而增強(qiáng)其功能， 作者 將其與傳統(tǒng)2D培養(yǎng)進(jìn)行比較 。發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)顯著增加了混合集落（來源于更原始、多能性細(xì)胞）的輸出，單細(xì)胞來源的集落中所含譜系數(shù)量有增加趨勢，且集落細(xì)胞數(shù)量更高。小鼠移植實(shí)驗(yàn)顯示，3D組顯示出更高的克隆形成能力。以上說明 Nichoids能顯著增強(qiáng)HSPCs在體外培養(yǎng)后的功能，證明3D信號在維持干細(xì)胞特性中起關(guān)鍵作用 。

隨后，為闡明nichoids增強(qiáng)HSPCs功能的分子和細(xì)胞機(jī)制，研究者分析了其引起的轉(zhuǎn)錄組變化，并觀察了對細(xì)胞形態(tài)、骨架和核結(jié)構(gòu)的影響。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)顯著重塑HSPCs轉(zhuǎn)錄譜，上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)、粘附和細(xì)胞骨架相關(guān)通路，下調(diào)DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂和氧化呼吸等通路。3D培養(yǎng)的HSPCs在第7天增殖更慢，氧化應(yīng)激更低，DNA損傷更少，p38 MAPK激活減少。形態(tài)上，3D培養(yǎng)的HSPCs體積更小、更接近球形，且3D細(xì)胞的微管蛋白呈現(xiàn)極化或?qū)ΨQ分布。以上說明 nichoids通過機(jī)械生物學(xué)調(diào)控，防止了2D培養(yǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞形變和核擠壓，維持了核形態(tài)和微管蛋白極性，從而減少了增殖壓力、氧化應(yīng)激和DNA損傷，保留了干細(xì)胞特性 。

那么nichoids預(yù)培養(yǎng)能否改善涉及額外操作壓力的基因編輯流程，并提升編輯后HSPCs的長期植入能力呢？通過將2D/3D預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞分別進(jìn)行基因編輯，作者發(fā)現(xiàn)nichoids預(yù)培養(yǎng)不影響編輯效率，且提高了編輯后細(xì)胞的混合集落輸出。在移植實(shí)驗(yàn)中，3D預(yù)培養(yǎng)組小鼠在外周血、骨髓和脾臟中的人源細(xì)胞嵌合率更高。二次移植結(jié)果顯示，3D組在所有造血器官中的植入均更高，且HDR編輯細(xì)胞的百分比增加了3-6倍。值得注意的是，在mPB來源的HSPCs中使用堿基編輯（ABE8.20-m）和引物編輯（PE3max）敲除B2M基因，也觀察到相似的體外結(jié)果。以上說明 nichoids支持跨多個(gè)平臺（Cas9/AAV6，BE，PE）的高效基因編輯，并通過維持功能性干細(xì)胞池，顯著提高了編輯后HSPCs的長期重建能力 。

現(xiàn)有的大多數(shù)已上市或后期開發(fā)的HSPCs基因療法依賴于慢病毒介導(dǎo)的基因添加，于是作者測試了nichoids能否進(jìn)一步優(yōu)化這類臨床相關(guān)方案。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果提示3D培養(yǎng)不影響細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，可提高轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞的紅系和混合集落形成潛能。移植后，3D組小鼠在外周血、骨髓和脾臟中的人源嵌合率更高。3D組的估計(jì)克隆群體規(guī)模更大，克隆多樣性更高，且未在癌基因或抑癌基因位點(diǎn)出現(xiàn)常見整合位點(diǎn)的富集。這說明 即使短暫的36小時(shí)nichoids培養(yǎng)，也能提高慢病毒基因添加后HSPCs的植入能力和克隆多樣性，且不增加基因毒性風(fēng)險(xiǎn) 。來自臨床WAS（Wiskott-Aldrich綜合征）患者的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 3D培養(yǎng)能增強(qiáng)WAS患者來源的基因校正HSPCs的植入能力和克隆復(fù)雜性 ，為更安全、更有效的臨床應(yīng)用提供了支持。

總的來說， 該研究提出了一種創(chuàng)新且可轉(zhuǎn)化的3D培養(yǎng)策略，能夠顯著提升造血干細(xì)胞基因治療的安全性與有效性，尤其適用于需要長期植入和多克隆重建的臨床場景。這一平臺技術(shù)有望推動(dòng)更多基因治療從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2025.12.016

制版人： 十一

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