VIRULENCE|華南農業大學黃耀偉教授在豬新發病毒致病性研究取得進展

近日，華南農業大學獸醫學院 /動物疫病防控全國重點實驗室黃耀偉教授團隊在《Virulence》在線發表題為"Cleavage of cellular substrate porcine gasdermin D by porcine torovirus 3C-like protease induces pyroptosis"的研究工作首次鑒定出一種新發病毒——豬凸隆病毒（PToV）主要蛋白酶的宿主底物，豬gasdermin D（pGSDMD）。

套式病毒目（Nidovirales）的冠狀病毒科和動脈炎病毒科成員包括多種危害人類與經濟動物的致病病毒，如SARS-CoV-2、PEDV、PRRSV等。該病毒目還有一種可以感染哺乳動物的凸隆病毒（torovirus），長期以來沒有得到關注。凸隆病毒是冠狀病毒的“近親”，但已經從冠狀病毒科分出，獨立成為新的一個病毒科Tobaniviridae。凸隆病毒在經濟動物中（豬、牛、馬等）感染率較高，近年發現其在野生動物與水生脊椎動物中也廣泛存在，并與冠狀病毒發生交叉重組。凸隆病毒基因組結構與編碼蛋白與冠狀病毒類似，同樣編碼3C樣蛋白酶（3CLP）這一病毒主要蛋白酶（MPro）用于剪切病毒多聚蛋白前體pp1a及pp1ab，產生多種成熟的非結構蛋白。而RNA病毒的3CP或3CLP除了剪切加工宿主多聚蛋白外，還靶向切割多種宿主蛋白底物使其失活，有利于拮抗宿主抗病毒反應包括先天免疫應答，使病毒適應在宿主細胞的生存。凸隆病毒與冠狀病毒的3CLP在催化位點及底物識別方面有一定差異，前者為絲氨酸蛋白酶，而后者為半胱氨酸蛋白酶。迄今已報道了冠狀病毒及動脈炎病毒的3CLP的多種宿主底物，但凸隆病毒3CLP的特異性宿主底物還沒有被發現。

本研究發現了第一種可以被凸隆病毒家族成員3CLP識別的細胞底物蛋白pGSDMD。GSDMD是引發細胞焦亡的主要“執行者”，此前已報道多種冠狀病毒3CLP通過剪切人和豬GSDMD從而抑制焦亡有助于病毒感染，但本研究則意外發現PToV 3CLP剪切pGSDMD的后果為促進焦亡發生。PToV 3CLP是如何通過切割pGSDMD導致焦亡發生的？課題組分別對PToV 3CLP和pGSDMD進行點突變研究，發現PToV 3CLP的兩個催化活性二聯體氨基酸His-53及Ser-160對剪切pGSDMD是必需的；而pGSDMD被3CLP在N端切出兩個片段：1-193與1-277，只有pGSDMD1-277片段通過在細胞膜成孔導致焦亡發生。當Gln-277(Q277)突變后，PToV 3CLP不能識別該位點，pGSDMD1-277片段沒有被切開，則焦亡不再產生。已知在宿主細胞焦亡信號通路上，pCaspase-1切割pGSDMD的D279位產生pGSDMD1-279片段引起焦亡。因此，在機制上pGSDMD1-277通過模擬pGSDMD1-279片段發揮作用。相反，冠狀病毒（PEDV或PDCoV等）3CLP因為不能識別pGSDMD的Q277而只識別Q193，從而其后果是拮抗焦亡。

進一步，PToV的3CLP切割pGSDMD這一細胞底物能否適用于其它動物ToV對其對應宿主GSDMD的識別？目前已發現了豬、牛、山羊、馬ToV（PToV，BToV，CToV，EToV），通過序列分析，它們對應的不同種屬GSDMD在Q193位點高度保守，但是在277位，只有豬、牛、山羊的GSDMD是Q，而馬和人的GSDMD不是。因此推測只有牛和山羊的GSDMD也能被BToV與CToV 3CLP切割。這可能反映了凸隆病毒科不同種類的ToV 3CLP與對應的宿主GSDMD底物之間在長期共演化過程中出現的“軍備競賽”結果。

由于豬腸道冠狀病毒與PToV在豬場中普遍存在，均引起仔豬腹瀉，但前者臨床致病性較強，而后者一般認為較弱，這可以部分地通過其不同3CLP誘發焦亡的后果加以解釋：豬冠狀病毒3CLP抑制焦亡，有利于病毒在宿主細胞感染，而PToV 3CLP促進焦亡釋放炎癥因子，限制了PToV的傳播。因此，盡管pGSDMD都是凸隆病毒和冠狀病毒3CLP的細胞識別底物，但是效應則完全相反。

本研究鑒定出第一種被凸隆病毒3CLP識別的宿主底物GSDMD及在促進細胞焦亡中的作用，為進一步研究ToV的3CLP生化特征與功能奠定基礎。其次，意外發現PToV 3CLP剪切pGSDMD的后果與冠狀病毒3CLP的抑制焦亡作用相反，為研究套式病毒目不同成員，特別是冠狀病毒及其“近親”病毒的主要蛋白間差異、套式病毒與宿主相互作用的多樣性與復雜性提供了新的見解；同時也為解答豬場臨床生產實踐中仔豬腹瀉在不同病原感染下癥狀不盡相同的疑惑提供線索。