VIRULENCE|華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃耀偉教授在豬新發(fā)病毒致病性研究取得進展

近日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 /動物疫病防控全國重點實驗室黃耀偉教授團隊在《Virulence》在線發(fā)表題為"Cleavage of cellular substrate porcine gasdermin D by porcine torovirus 3C-like protease induces pyroptosis"的研究工作首次鑒定出一種新發(fā)病毒——豬凸隆病毒（PToV）主要蛋白酶的宿主底物，豬gasdermin D（pGSDMD）。

套式病毒目（Nidovirales）的冠狀病毒科和動脈炎病毒科成員包括多種危害人類與經(jīng)濟動物的致病病毒，如SARS-CoV-2、PEDV、PRRSV等。該病毒目還有一種可以感染哺乳動物的凸隆病毒（torovirus），長期以來沒有得到關(guān)注。凸隆病毒是冠狀病毒的“近親”，但已經(jīng)從冠狀病毒科分出，獨立成為新的一個病毒科Tobaniviridae。凸隆病毒在經(jīng)濟動物中（豬、牛、馬等）感染率較高，近年發(fā)現(xiàn)其在野生動物與水生脊椎動物中也廣泛存在，并與冠狀病毒發(fā)生交叉重組。凸隆病毒基因組結(jié)構(gòu)與編碼蛋白與冠狀病毒類似，同樣編碼3C樣蛋白酶（3CLP）這一病毒主要蛋白酶（MPro）用于剪切病毒多聚蛋白前體pp1a及pp1ab，產(chǎn)生多種成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白。而RNA病毒的3CP或3CLP除了剪切加工宿主多聚蛋白外，還靶向切割多種宿主蛋白底物使其失活，有利于拮抗宿主抗病毒反應(yīng)包括先天免疫應(yīng)答，使病毒適應(yīng)在宿主細胞的生存。凸隆病毒與冠狀病毒的3CLP在催化位點及底物識別方面有一定差異，前者為絲氨酸蛋白酶，而后者為半胱氨酸蛋白酶。迄今已報道了冠狀病毒及動脈炎病毒的3CLP的多種宿主底物，但凸隆病毒3CLP的特異性宿主底物還沒有被發(fā)現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)了第一種可以被凸隆病毒家族成員3CLP識別的細胞底物蛋白pGSDMD。GSDMD是引發(fā)細胞焦亡的主要“執(zhí)行者”，此前已報道多種冠狀病毒3CLP通過剪切人和豬GSDMD從而抑制焦亡有助于病毒感染，但本研究則意外發(fā)現(xiàn)PToV 3CLP剪切pGSDMD的后果為促進焦亡發(fā)生。PToV 3CLP是如何通過切割pGSDMD導(dǎo)致焦亡發(fā)生的？課題組分別對PToV 3CLP和pGSDMD進行點突變研究，發(fā)現(xiàn)PToV 3CLP的兩個催化活性二聯(lián)體氨基酸His-53及Ser-160對剪切pGSDMD是必需的；而pGSDMD被3CLP在N端切出兩個片段：1-193與1-277，只有pGSDMD1-277片段通過在細胞膜成孔導(dǎo)致焦亡發(fā)生。當(dāng)Gln-277(Q277)突變后，PToV 3CLP不能識別該位點，pGSDMD1-277片段沒有被切開，則焦亡不再產(chǎn)生。已知在宿主細胞焦亡信號通路上，pCaspase-1切割pGSDMD的D279位產(chǎn)生pGSDMD1-279片段引起焦亡。因此，在機制上pGSDMD1-277通過模擬pGSDMD1-279片段發(fā)揮作用。相反，冠狀病毒（PEDV或PDCoV等）3CLP因為不能識別pGSDMD的Q277而只識別Q193，從而其后果是拮抗焦亡。

進一步，PToV的3CLP切割pGSDMD這一細胞底物能否適用于其它動物ToV對其對應(yīng)宿主GSDMD的識別？目前已發(fā)現(xiàn)了豬、牛、山羊、馬ToV（PToV，BToV，CToV，EToV），通過序列分析，它們對應(yīng)的不同種屬GSDMD在Q193位點高度保守，但是在277位，只有豬、牛、山羊的GSDMD是Q，而馬和人的GSDMD不是。因此推測只有牛和山羊的GSDMD也能被BToV與CToV 3CLP切割。這可能反映了凸隆病毒科不同種類的ToV 3CLP與對應(yīng)的宿主GSDMD底物之間在長期共演化過程中出現(xiàn)的“軍備競賽”結(jié)果。

由于豬腸道冠狀病毒與PToV在豬場中普遍存在，均引起仔豬腹瀉，但前者臨床致病性較強，而后者一般認(rèn)為較弱，這可以部分地通過其不同3CLP誘發(fā)焦亡的后果加以解釋：豬冠狀病毒3CLP抑制焦亡，有利于病毒在宿主細胞感染，而PToV 3CLP促進焦亡釋放炎癥因子，限制了PToV的傳播。因此，盡管pGSDMD都是凸隆病毒和冠狀病毒3CLP的細胞識別底物，但是效應(yīng)則完全相反。

本研究鑒定出第一種被凸隆病毒3CLP識別的宿主底物GSDMD及在促進細胞焦亡中的作用，為進一步研究ToV的3CLP生化特征與功能奠定基礎(chǔ)。其次，意外發(fā)現(xiàn)PToV 3CLP剪切pGSDMD的后果與冠狀病毒3CLP的抑制焦亡作用相反，為研究套式病毒目不同成員，特別是冠狀病毒及其“近親”病毒的主要蛋白間差異、套式病毒與宿主相互作用的多樣性與復(fù)雜性提供了新的見解；同時也為解答豬場臨床生產(chǎn)實踐中仔豬腹瀉在不同病原感染下癥狀不盡相同的疑惑提供線索。