已上市16款雙抗的藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬選擇依據(jù)匯總

雙抗和單抗在藥理學(xué)相關(guān)種屬選擇方面還是有些區(qū)別的。單抗比較簡(jiǎn)單，與對(duì)應(yīng)種屬的目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合或能產(chǎn)生藥理學(xué)作用，則基本可判定相關(guān)與否。雙抗則會(huì)多出一些變化，會(huì)出現(xiàn)單靶點(diǎn)相關(guān)、雙靶點(diǎn)相關(guān)和雙靶點(diǎn)均不相關(guān)的情形。對(duì)于雙抗的相關(guān)動(dòng)物種屬選擇，已上市雙抗藥物通常開(kāi)展哪些研究作為判斷依據(jù)呢？不相關(guān)或僅單靶點(diǎn)相關(guān)的情況如何處理呢？結(jié)合已上市的這16款雙抗的案例，一起來(lái)看下，總有一款適合你。

已上市雙抗的基本信息統(tǒng)計(jì)如下表所示：

已上市雙抗的藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬選擇依據(jù)及毒理用種屬統(tǒng)計(jì)如下表所示：

接下來(lái)圍繞每款雙抗的種屬選擇詳細(xì)信息，逐一進(jìn)行介紹：

1、Blinatumomab

Blinatumomab是一款CD19/CD3雙抗。相關(guān)動(dòng)物種屬選擇方面，開(kāi)展了兩項(xiàng)研究。

第一項(xiàng)研究。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，blinatumomab能與黑猩猩的B淋巴細(xì)胞（CD20+）和T淋巴細(xì)胞（CD4+）結(jié)合，但不能與SJL小鼠、比格犬、食蟹猴、恒河猴以及狒狒的相應(yīng)淋巴細(xì)胞結(jié)合。在黑猩猩外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）樣本中，blinatumomab與B和T淋巴細(xì)胞結(jié)合后，可介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞的重定向裂解作用，該效應(yīng)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的自體耗竭實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。

第二項(xiàng)研究。采用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估blinatumomab對(duì)非洲綠猴、松鼠猴、大鼠（F344品系）、小鼠（ND4SwissWebster品系）及人PBMC的交叉反應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，blinatumomab可與人CD20+B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)合，但不與非洲綠猴、松鼠猴、大鼠和小鼠的PBMC發(fā)生結(jié)合。

顯而易見(jiàn)，Amgen很想找到一種猴作為相關(guān)動(dòng)物種屬，可惜試了多個(gè)品系都不結(jié)合。最后無(wú)奈，只能制備了鼠源替代分子開(kāi)展小鼠一般毒理研究（IV，QD，給藥4周，4周恢復(fù)期，對(duì)照組+3個(gè)給藥組）。另外，黑猩猩作為唯一的非人靈長(zhǎng)類(lèi)相關(guān)動(dòng)物種屬，也進(jìn)行了一般毒理學(xué)研究（QW，5周，對(duì)照組1只雌性，給藥組1雌1雄，僅給藥1個(gè)劑量）。

2、Emicizumab

在正常止血過(guò)程中，活化的凝血因子VIII（FVIIIa）在Ca2?和磷脂存在下與活化的凝血因子IX（FIXa）形成復(fù)合物。該FVIIIa:FIXa復(fù)合物作為輔因子，促進(jìn)凝血因子X(jué)（FX）的活化。

在A型血友病患者中，F(xiàn)VIII缺乏或缺失。此時(shí)，emicizumab通過(guò)分子模擬機(jī)制發(fā)揮作用：它作為一種支架蛋白，直接結(jié)合活化的FIXa和FX，并將其橋接在活化血小板表面，從而促進(jìn)FX的活化。

結(jié)合親和力研究：采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)，在濃度高達(dá)640nM的條件下，證實(shí)了emicizumab能以濃度依賴(lài)的方式與人和食蟹猴的天然及活化形式的FIX和FX結(jié)合。

對(duì)人和食蟹猴凝血因子的輔因子活性評(píng)估：通過(guò)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了emicizumab在hFIXa存在下對(duì)純化hFX的活化作用。結(jié)果顯示，當(dāng)存在hFIXa時(shí)，隨著emicizumab濃度增加，F(xiàn)Xa生成量呈濃度依賴(lài)性上升；若無(wú)hFIXa，則無(wú)FX活化；用FVIIIa替代emicizumab時(shí)，也觀察到類(lèi)似效果。

在使用食蟹猴FX（cyFX）的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)中，emicizumab同樣表現(xiàn)出促進(jìn)FX活化的作用。

然而，在使用小鼠或大鼠的FIXa和FX進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，emicizumab未能誘導(dǎo)FX的活化。

所以，通過(guò)結(jié)合和功能試驗(yàn)確定了食蟹猴為藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬。

3、Amivantamab

Amivantamab是一款EGFR/MET雙抗。在結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，amivantamab與人EGFR和MET的結(jié)合親和力（KD值）分別為1.43nM和0.04nM。

Amivantamab能與人和食蟹猴EGFR及MET的胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）結(jié)合，且EC50值相近；但對(duì)大鼠的EGFR或MET無(wú)明顯結(jié)合。

4、Faricimab

Faricimab（RO6867461）是一款A(yù)ng-2/VEGF雙抗，結(jié)合特性如下：

對(duì)Ang-2的結(jié)合：

Faricimab通過(guò)SPR技術(shù)檢測(cè)，對(duì)全長(zhǎng)血管生成素-2（Ang-2）表現(xiàn)出高親和力，且在多個(gè)種屬中均有效，包括人、食蟹猴、兔和小鼠。此外，faricimab也能高親和力地結(jié)合大鼠Ang-2的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Ang-2-RBD-Fc）。

Faricimab不結(jié)合全長(zhǎng)人Ang-1，但能特異性結(jié)合Ang-2。

對(duì)VEGF的結(jié)合：

Faricimab對(duì)人和大鼠的VEGF121以及人VEGF165均表現(xiàn)出高親和力。

由于人、食蟹猴和恒河猴的VEGF121氨基酸序列完全一致（100%同源），因此未對(duì)食蟹猴VEGF121進(jìn)行單獨(dú)的結(jié)合測(cè)試。

Faricimab采用兔和猴開(kāi)展了短期重復(fù)給藥毒理研究。未選擇鼠，可能是與眼部解剖和生理學(xué)特點(diǎn)與人差別比較大有關(guān)。當(dāng)然，兔也不是一個(gè)理想種屬。FDA Lansita博士認(rèn)為兔并非合適的毒理學(xué)研究種屬，因?yàn)樵趩未尾Ａw內(nèi)注射（IVT）低劑量（1.5 mg/眼）后即出現(xiàn)嚴(yán)重毒性（可能與種屬相關(guān)的抗藥抗體所致的免疫復(fù)合物沉積相關(guān)），使得在該物種中開(kāi)展長(zhǎng)期毒性研究不可行，除非探索更低劑量。她支持申辦方的提議，僅使用猴進(jìn)行計(jì)劃中的6個(gè)月慢性毒性研究。

5、Mosunetuzumab

為評(píng)估雙特異性抗體mosunetuzumab的跨種屬體外結(jié)合能力與活性，研究對(duì)其抗CD3抗體臂與人和食蟹猴CD3εγ抗原的結(jié)合親和力進(jìn)行了檢測(cè)。

結(jié)果顯示：

Mosunetuzumab對(duì)人和食蟹猴CD3εγ抗原的結(jié)合親和力相當(dāng)；在人和食蟹猴的PBMCs中，其介導(dǎo)B細(xì)胞殺傷的體外藥效也相當(dāng)。

然而，由于技術(shù)限制，未能開(kāi)發(fā)出穩(wěn)定、可重復(fù)且準(zhǔn)確的免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)方法，用于評(píng)估m(xù)osunetuzumab在人和食蟹猴組織中的特異性結(jié)合及潛在交叉反應(yīng)性。原因在于：mosunetuzumab作為IHC檢測(cè)試劑時(shí)，分析靈敏度和特異性較差。

此外，未在其他種屬（如嚙齒類(lèi)動(dòng)物、犬或兔）中開(kāi)展交叉反應(yīng)性研究。

6、Teclistamab

Teclistamab是一種CD3/BCMA雙特異性抗體，其結(jié)合活性顯示：與人BCMA具有高親和力，平均Kd為0.18nM；與人CD3的Kd為28.03nM。

在食蟹猴中：與食蟹猴BCMA，平均Kd為6.5nM，約為對(duì)人BCMA親和力的1/36（即弱36倍）；與食蟹猴CD3的Kd為38.48nM。

在其他種屬中：Teclistamab對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物（如小鼠、大鼠），僅表現(xiàn)為微弱結(jié)合；不與嚙齒類(lèi)或兔的CD3發(fā)生交叉反應(yīng)。

因此，嚙齒類(lèi)動(dòng)物和兔不是teclistamab毒性評(píng)價(jià)的藥理學(xué)相關(guān)種屬。

基于上述數(shù)據(jù)，食蟹猴被確定為teclistamab安全性評(píng)價(jià)中最合適的藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬。

除了親和力方面的研究，還開(kāi)展了體外功能活性驗(yàn)證。

在人源系統(tǒng)中（hBCMA+CHO細(xì)胞+人T細(xì)胞，效靶比E:T=5:1）：誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的EC50為0.22–0.32nM；介導(dǎo)對(duì)BCMA表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒性（殺傷作用）的EC50為0.31–0.89nM。

在食蟹猴系統(tǒng)中（cBCMA+CHO細(xì)胞+食蟹猴T細(xì)胞）：T細(xì)胞活化的EC50為1.38–3.9nM；細(xì)胞毒性的EC50為0.64–3.3nM。

7、Epcoritamab

Epcoritamab是一款CD3/CD20雙抗，種屬交叉反應(yīng)性評(píng)估：

使用轉(zhuǎn)染了不同物種CD20的HEK293F細(xì)胞（包括人、食蟹猴、犬、兔、豬、大鼠、小鼠），評(píng)估epcoritamab對(duì)非人源CD20的交叉反應(yīng)性。結(jié)果顯示，僅食蟹猴和兔的CD20能與epcoritamab發(fā)生劑量依賴(lài)性結(jié)合。其中，食蟹猴CD20的EC50與人CD20相當(dāng)。

對(duì)CD3的交叉反應(yīng)性研究使用人Jurkat T細(xì)胞系和食蟹猴HSC-FT細(xì)胞系，結(jié)果顯示，人與食蟹猴CD3的結(jié)合親和力相當(dāng)。

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)（Conrad,2007,Cytometry），epcoritamab預(yù)期與其他非人種屬（如犬、鼠、豬等）不結(jié)合。

因此，epcoritamab僅在食蟹猴中具有藥理學(xué)相關(guān)性。

8、Glofitamab

Glofitamab在體外以二價(jià)模式（bivalent mode）結(jié)合人和食蟹猴原代B細(xì)胞表面的CD20，且對(duì)兩者的EC50值相當(dāng)，表明其在兩個(gè)種屬中具有相似的結(jié)合效力。Glofitamab不與常規(guī)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如嚙齒類(lèi)、犬、兔或小型豬）的CD20發(fā)生交叉反應(yīng)。

同時(shí)，glofitamab以單價(jià)模式（monovalent mode）結(jié)合T細(xì)胞受體（TCR）復(fù)合物中的CD3ε亞基。由于人與食蟹猴的CD3ε表位高度保守，glofitamab可交叉識(shí)別這兩個(gè)種屬的CD3ε；但不能結(jié)合上述常規(guī)毒理學(xué)動(dòng)物（嚙齒類(lèi)、犬、兔、小型豬）的CD3ε。

9、Elranatamab

Elranatamab是一款CD3/BCMA雙抗，用于相關(guān)動(dòng)物種屬選擇的結(jié)合親和力研究結(jié)果：

對(duì)BCMA和CD3εδ的結(jié)合（SPR）：通過(guò)SPR測(cè)定了elranatamab對(duì)人、食蟹猴、小鼠和大鼠BCMA的結(jié)合親和力；同時(shí)測(cè)定了其對(duì)人和食蟹猴CD3εδ的結(jié)合親和力。

對(duì)CD3εN端肽段的結(jié)合（BLI）：在1μM濃度下，elranatamab不結(jié)合小鼠和大鼠CD3ε的N端肽段，進(jìn)一步說(shuō)明其對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物CD3缺乏交叉反應(yīng)性。

故，通過(guò)親和力研究確認(rèn)，食蟹猴為本品唯一藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬。

10、Talquetamab

Talquetamab是一款CD3/GPRC5D雙抗，相關(guān)種屬選擇方面開(kāi)展了以下研究。Talquetamab與人、猴T細(xì)胞結(jié)合，EC50分別為15.1、2.8nM。說(shuō)明，CD3這端，猴是相關(guān)動(dòng)物種屬。

不過(guò)，GPRC5D這端，talquetamab不與表達(dá)猴GPRC5D的細(xì)胞結(jié)合。其它種屬方面，未開(kāi)展具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從蛋白序列層面就排除了結(jié)合的可能性。

所以，僅CD3一端相關(guān)是沒(méi)有意義的，talquetamab無(wú)合適的藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬。最終選擇開(kāi)發(fā)了一款結(jié)合猴CD3和GPRC5D的替代雙抗分子開(kāi)展的毒理研究。

11、Odronextamab

Odronextamab是一款CD3/CD20雙抗。相關(guān)動(dòng)物種屬選擇方面開(kāi)展了如下研究：

在人和食蟹猴全血中評(píng)估了odronextamab誘導(dǎo)以下效應(yīng)的能力：PBMC增殖；T細(xì)胞激活及細(xì)胞因子釋放；T細(xì)胞介導(dǎo)的CD20陽(yáng)性細(xì)胞裂解。結(jié)果顯示，在共刺激抗體抗-CD28存在下，odronextamab可有效誘導(dǎo)人和食蟹猴PBMC增殖，其EC50分別為55pM、33.3pM。

細(xì)胞結(jié)合方面，Odronextamab不與小鼠或大鼠來(lái)源的B細(xì)胞或T細(xì)胞結(jié)合，說(shuō)明其種屬特異性較強(qiáng)。

不難看出，食蟹猴為本品藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬。

12、Tarlatamab

Tarlatamab是一款CD3/DLL3雙抗，藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬選擇主要開(kāi)展了以下試驗(yàn)：

SPR親和力研究表明，tarlatamab可以結(jié)合人、猴CD3，KD值約為14.9、12nM。

細(xì)胞結(jié)合研究表明，tarlatamab可以結(jié)合過(guò)表達(dá)人、猴DLL3的CHO細(xì)胞，KD值約為0.64、0.5nM。

另外，tarlatamab可以結(jié)合人、猴T細(xì)胞，不結(jié)合小鼠、大鼠、兔、犬和小型豬的T細(xì)胞。

所以，從結(jié)合層面考量，食蟹猴被選為本品的毒理學(xué)研究種屬。但是，考慮到DLL3在健康細(xì)胞和組織中僅表達(dá)于胞內(nèi)，并非表達(dá)在細(xì)胞表面，所以嚴(yán)格意義上講，健康食蟹猴也未必是合適的藥理學(xué)相關(guān)動(dòng)物種屬。

13、Zenocutuzumab

Zenocutuzumab是一款HER2/HER3雙抗。

流式分析結(jié)果顯示，Zenocutuzumab能結(jié)合表達(dá)人和食蟹猴HER2或HER3的CHO細(xì)胞。

然而，在體外實(shí)驗(yàn)中，其抗-HER2 Fab不與嚙齒類(lèi)（大鼠/小鼠）結(jié)合。

序列同源性分析顯示：食蟹猴與人HER2/HER3的氨基酸序列相似性高達(dá)98–99%；而人與嚙齒類(lèi)的HER2相似性為85–88%，HER3為91–93%。

基于上述結(jié)合特性和高序列保守性，食蟹猴被確認(rèn)為zenocutuzumab毒性研究的藥理學(xué)相關(guān)種屬。

14、Zanidatamab

Zanidatamab是一款HER2雙表位抗體。

申辦方并未對(duì)逐個(gè)表位的種屬結(jié)合差異進(jìn)行研究，而是采用不同物種HER2胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）開(kāi)展的結(jié)合親和力研究。

結(jié)果顯示：zanidatamab對(duì)人和食蟹猴HER2ECD的結(jié)合親和力相近，KD分別為0.74nM和0.47nM；對(duì)犬的親和力較低（Kd=4.07nM）；對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物（大鼠/小鼠）則無(wú)明顯結(jié)合。

基于上述數(shù)據(jù)，食蟹猴被確定為zanidatamab最合適的非臨床相關(guān)種屬。

15、Cadonilimab和Ivonescimab

Cadonilimab 和Ivonescimab是康方開(kāi)發(fā)的兩款雙抗，分別是PD-1/CTLA-4雙抗、PD-1/VEGF-A雙抗。未看到具體種屬選擇性研究資料。從經(jīng)驗(yàn)判斷，目前已上市所有PD-1抗體均不結(jié)合嚙齒類(lèi)動(dòng)物PD-1。已上市VEGF-A抗體Avastin不具備嚙齒類(lèi)動(dòng)物藥理學(xué)活性。從CDE披露的技術(shù)審評(píng)報(bào)告，兩款抗體均采用的食蟹猴開(kāi)展的毒理研究。

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