Journal of Virology | RNA解旋酶DDX5調控FMDV-IRES依賴性翻譯和基因組復制

口蹄疫病毒（FMDV）是嚴重危害畜牧業健康發展的動物病毒，而劫持宿主翻譯系統實現自身mRNA優先翻譯則是病毒建立胞內感染的關鍵步驟和限速環節，但其翻譯調控機制尚不明確。近期，本團隊發表于《Journal of Virology》的文章通過RNA親和捕捉法和RNA免疫共沉淀技術，結合互作組學分析和基因敲除等方法，系統解析了DDX5調控FMDV-IRES依賴性翻譯和基因組復制的分子機制，為深入理解病毒突破宿主翻譯限制的調控網絡，以及開發靶向病毒-宿主互作的新型抗病毒策略提供了理論依據。

文章摘要

內部核糖體進入位點（IRES）是許多病毒mRNA中的一種順式作用結構元件，通過招募多種RNA結合蛋白及IRES反式作用因子（ITAFs）介導非帽依賴性翻譯。口蹄疫病毒（FMDV）作為小核糖核酸病毒科的重要成員，其基因組包含功能性IRES元件，在病毒蛋白翻譯與RNA合成中發揮關鍵作用。本研究揭示了一種此前未知的調控機制：DEAD-box RNA解旋酶5（DDX5）作為新型ITAF，通過兩種獨立策略抑制口蹄疫病毒的翻譯與RNA合成。首先，DDX5結合IRES的D4結構域，通過阻斷80S核糖體組裝抑制IRES驅動的病毒翻譯；其次，DDX5與病毒RNA依賴性RNA聚合酶3Dpol及病毒3′UTR相互作用，破壞病毒RNA合成過程。有趣的是，病毒前體蛋白3ABCD通過3Cpro介導的蛋白酶解作用可拮抗DDX5的抑制功能。體內實驗進一步證實了DDX5在口蹄疫病毒致病機制中的關鍵作用。這些發現深化了我們對病毒如何利用或拮抗宿主因子調控IRES驅動翻譯的理解，為病毒感染過程中的翻譯控制機制提供了新視角。

結果展示

1.DDX5參與FMDV增殖

通過PK-15細胞感染FMDV發現，DDX5在mRNA水平上調但蛋白表達下降。敲低DDX5后，病毒RNA、結構蛋白及病毒滴度均顯著升高，但不影響組裝與釋放，表明DDX5在FMDV復制過程中可能起到限制性作用(圖1)。

圖1 DDX5參與FMDV增殖

2.DDX5負向調控FMDV增殖

利用CRISPR-Cas9技術構建DDX5敲除細胞系，發現DDX5缺失顯著促進FMDV增殖，而過表達則抑制病毒復制。通過截短突變體功能分析，發現全長DDX5具有抑制FMDV復制的完整能力，而僅包含N端DEAD盒、C端解旋酶結構域或P68HR區域的結構均無法單獨發揮作用，表明DDX5是FMDV復制的關鍵負調控因子，其完整結構對其抗病毒功能至關重要(圖2)。

圖2 DDX5對FMDV的復制和增殖具有抑制作用

3.DDX5抑制FMDV-IRES依賴性翻譯

通過轉染FMDV亞基因組復制子RNA，發現DDX5敲除促進EGFP表達，而過表達DDX5則抑制復制子活性，提示DDX5影響FMDV的翻譯和/或復制。利用雙熒光素酶報告系統進一步證實，DDX5能特異性抑制FMDV和EMCV的 IRES翻譯，但對PV（I型）、CSFV（III型）和SVA（IV型）的IRES無影響。結果表明DDX5是FMDV IRES翻譯的負調控因子(圖3)。

圖3 DDX5是FMDV IRES翻譯的負調控因子

4.分析DDX5與FMDV-IRES和3’UTR相互作用

通過RNA互作實驗證實，DDX5可直接特異性結合FMDV RNA的IRES及3′UTR區域，其中IRES的D4結構域是關鍵結合區。此外，激光共聚焦實驗顯示FMDV感染可誘導DDX5在感染后期（6小時）從細胞核向細胞質轉位。這些結果表明，DDX5通過與病毒RNA關鍵區域直接互作，并在感染后發生亞細胞重定位，從而可能參與對病毒復制的調控(圖4)。

圖 4 DDX5與FMDV-IRES和3’UTR相互作用

5.DDX5不直接調控FMDV mRNA翻譯起始

通過蔗糖密度梯度離心分析，發現FMDV感染會破壞宿主細胞的全局翻譯，誘導DDX5部分結合至40S核糖體亞基。并與eIF4G、PABP等翻譯起始因子互作，提示其可能參與調控FMDV IRES介導的翻譯起始。然而，DDX5敲低并不影響IRES對eIF2α、eIF3e等關鍵因子的招募，表明其不參與翻譯起始復合物的核心組裝，而更可能作為調節因子，在后續步驟（如60S亞基的加入）中發揮作用，從而干擾功能性80S核糖體的形成(圖5)。

圖 5 DDX5不影響FMDV IRES對關鍵起始因子的招募

6.DDX5干擾FMDV-IRES上的80S核糖體組裝

通過多聚核糖體圖譜分析發現DDX5抑制FMDV IRES依賴性翻譯。敲除DDX5使病毒mRNA向多聚核糖體區偏移并增加其豐度，而過表達則相反，表明DDX5特異性抑制病毒翻譯。體外實驗證實重組DDX5蛋白能直接抑制80S核糖體組裝。上述結果表明，DDX5通過阻斷60S亞基與43S前起始復合物的結合，抑制功能性80S核糖體形成，從而負調控FMDV IRES翻譯(圖6)。

圖 6 DDX5不影響FMDV IRES對關鍵起始因子的招募

7、DDX5通過與口蹄疫病毒3D聚合酶相互作用抑制病毒RNA合成

使用CHX分離翻譯和RNA合成過程發現，DDX5敲除能直接增強FMDV RNA水平。DDX5可與病毒聚合酶3Dpol直接互作并共定位，其互作由病毒感染或3Dpro誘導。為排除DDX5對IRES翻譯的潛在影響，構建了帽依賴性翻譯但復制缺陷的rFMDV-mCherry質粒，以及IRES突變但復制能力完整的rFMDV-EGFP復制子，結果表明，在抑制新蛋白合成后，DDX5敲除仍能顯著促進復制子RNA的積累(圖7)。

圖 7 DDX5與3Dpol互作抑制FMDV的RNA合成

8、口蹄疫病毒通過3ABCD蛋白酶前體拮抗DDX5介導的抑制

FMDV通過其前體蛋白3ABCD中的3C蛋白酶，特異性切割宿主DDX5蛋白第123位的谷氨酰胺（Gln-123），從而破壞其完整結構。該切割不被經典蛋白酶體、溶酶體或凋亡途徑抑制劑所抑制。切割產生的N端或C端片段均喪失抗病毒活性，證明該切割有效拮抗了DDX5對病毒復制的限制作用(圖8)。

圖 8 口蹄疫病毒通過3ABCD蛋白酶前體拮抗DDX5介導的抑制

9、DDX5敲降增強了小鼠對FMDV感染的易感性

在乳鼠體內利用腺病毒載體敲低DDX5表達，探究其在FMDV感染中的功能。結果顯示，與對照相比，DDX5敲低組小鼠的多個組織DDX5蛋白水平顯著下降。在FMDV攻毒后，敲低組小鼠全部在4天內死亡，而對照組在6天內全部死亡。同時，敲低組肌肉組織的病毒載量較對照組高出約10^2.1倍。這些結果表明，DDX5的敲低增強了乳鼠對FMDV的易感性(圖9)。

圖 9 DDX5敲降增強了小鼠對FMDV感染的易感性

全文總結及科學意義

研究結論與意義：

本研究系統闡明了DDX5在口蹄疫病毒（FMDV）感染中的雙重作用與病毒拮抗機制。DDX5通過直接結合病毒IRES（尤其是D4區）和3′UTR，抑制IRES介導的翻譯（阻斷80S核糖體組裝）及病毒RNA合成（與3Dpol互作），從而負調控病毒復制。然而，FMDV通過其前體蛋白3ABCD中的3C蛋白酶切割DDX5第123位氨基酸，使其失活以拮抗宿主限制(見下圖)。體內實驗證實，敲低DDX5會加劇乳鼠的病毒感染與致死率。總之，這些發現加深了對病毒如何利用或拮抗細胞因子來調節IRES驅動的翻譯的理解，并為病毒感染期間的翻譯控制提供了新的見解 。

該研究得到了甘肅省科技計劃項目（25JRRA1086、25JRA1089、24JRA804）和寧夏省重點研發計劃項目（2024BF02017）的支持。的資助。郭慧琛研究員為論文通訊作者，博士研究生吳金恩為第一作者。