CHO 細胞培養(yǎng)補料優(yōu)化：硫胺素的穩(wěn)定性與必要性大揭秘

摘要:本次針對生物制藥用細胞培養(yǎng)補料中的硫胺素展開研究，通過LC-MS/MS技術(shù)探究其在液體補料中的降解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)易氧化且與多種補料成分發(fā)生相互作用。經(jīng)批次補料實驗驗證，4種CHO細胞株在無硫胺素補料培養(yǎng)下，細胞性能、重組蛋白關(guān)鍵質(zhì)量屬性均未受影響，胞內(nèi)胞外代謝組也無顯著變化。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)室溫穩(wěn)定的濃縮補料提供了簡單可行的思路——移除這一不穩(wěn)定且非必需的維生素。

一、研究背景：細胞培養(yǎng)補料開發(fā)的核心痛點

做生物制藥細胞培養(yǎng)的同行都清楚，化學(xué)限定性補料是重組蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵。這類補料成分復(fù)雜，高濃度下的穩(wěn)定性一直是工業(yè)生產(chǎn)的難題。光照、溫度變化，都可能讓補料中的營養(yǎng)成分降解、相互作用，進而影響細胞生長和蛋白質(zhì)量。

硫胺素作為細胞能量代謝的必需維生素，本身易受溫度和氧化影響。在高濃度液體補料中，它的穩(wěn)定性到底如何，是否真的需要在補料中額外添加，都是亟待驗證的問題。畢竟開發(fā)室溫穩(wěn)定、成分精簡的補料，是工業(yè)生物制造的核心需求。

二、實驗設(shè)計：從穩(wěn)定性到必要性的全面驗證

本次研究分兩大核心部分，先搞清楚硫胺素的降解問題，再驗證它在補料中的必要性。穩(wěn)定性研究中，我們配置了3種定制化干粉補料，復(fù)溶后在23℃、37℃甚至70℃下避光儲存，最長達98天，用LC-MS/MS追蹤硫胺素及產(chǎn)物變化（圖1）。

圖1 維生素濃度在不同儲存條件、不同補料配方中的變化，紅色標注硫胺素易氧化還原的化學(xué)基團，灰色區(qū)域為方法學(xué)技術(shù)變異范圍

必要性驗證則用4種CHO細胞株做批次補料實驗，分別用含硫胺素和無硫胺素的補料培養(yǎng)，監(jiān)測細胞生長、活力、蛋白產(chǎn)量，同時分析蛋白糖基化、聚集、電荷變體等關(guān)鍵質(zhì)量屬性，還用非靶向LC-MS/MS分析胞內(nèi)胞外代謝組。

為了精準識別硫胺素的降解和相互作用產(chǎn)物，我們還設(shè)計了缺特定成分的補料實驗組，通過靶向搜索，區(qū)分純降解產(chǎn)物和與其他成分的相互作用產(chǎn)物，最終整理出硫胺素衍生特征物數(shù)據(jù)庫（表1）。

表1 儲存過程中檢測到的主要硫胺素降解/相互作用產(chǎn)物

產(chǎn)物類型

代表特征物m/z

相互作用/降解原因

含硫物質(zhì)相互作用產(chǎn)物

5.17_363.0789m/z

與S-磺基半胱氨酸形成二硫鍵

酮酸相互作用產(chǎn)物

4.65_249.0984m/z

與α-酮戊二酸發(fā)生反應(yīng)

氨基酸相互作用產(chǎn)物

6.56_287.1504m/z

與苯丙氨酸結(jié)合

氧化產(chǎn)物

6.23_263.0961m/z

硫胺素自身氧化生成硫色素

三、硫胺素穩(wěn)定性：易降解，還愛和多種成分“抱團”

儲存實驗的結(jié)果很直觀，硫胺素是補料中最不穩(wěn)定的維生素。23℃儲存3個月，其濃度顯著下降，37℃下降解速度更快，甚至70℃模擬快速降解時，短時間內(nèi)就會產(chǎn)生大量衍生產(chǎn)物（圖1A、B）。

硫胺素的降解核心是氧化，分子中多個化學(xué)基團對氧化還原高度敏感（圖1C）。更關(guān)鍵的是，它不只是自己降解，還會和補料中的其他成分發(fā)生相互作用。在含不同半胱氨酸源的補料中，硫胺素穩(wěn)定性進一步降低（圖1D、E），和含硫物質(zhì)、α-酮戊二酸、苯丙氨酸等氨基酸都能形成相互作用產(chǎn)物。

我們共檢測到74種可能的硫胺素衍生產(chǎn)物，其中23種為一級鑒定、37種為三級鑒定（圖2）。這些產(chǎn)物里，氧化產(chǎn)物、與含硫物質(zhì)的二硫鍵產(chǎn)物占比最高，37℃儲存時，這類產(chǎn)物的生成量會大幅增加，而添加α-酮戊二酸雖能抑制部分氧化，卻會催生新的相互作用產(chǎn)物。

圖2 硫胺素不穩(wěn)定性研究策略及降解/相互作用產(chǎn)物分類，紅色標注與硫胺素母核的結(jié)構(gòu)差異

有意思的是，我們測試了這些降解產(chǎn)物對CHO細胞的毒性，即便濃度達到1mM，也未發(fā)現(xiàn)細胞活力受影響，這一點倒是讓研究少了一層顧慮。

四、硫胺素必要性：補料中移除，完全不影響培養(yǎng)效果

這部分的實驗結(jié)果，是本次研究最核心的發(fā)現(xiàn)。4種不同的CHO細胞株，包括生產(chǎn)不同單抗和融合蛋白的細胞，在無硫胺素補料的培養(yǎng)體系中，生長狀態(tài)和含硫胺素的對照組幾乎一致。

細胞的活細胞密度峰值、存活期都無顯著差異，比如1號克隆活細胞密度峰值達16×10?cells/mL，2號克隆達17×10?cells/mL，無硫胺素補料組均能達到這一水平（圖4）。蛋白最終滴度也沒受影響，兩款單抗分別達到4g/L和7g/L，和對照組持平。

圖4 有無硫胺素補料時，CHO細胞的活細胞密度、存活率、蛋白滴度及重組蛋白聚集、電荷變體、糖基化特征

重組蛋白的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，是生物制藥的核心考核指標。我們檢測了蛋白的聚集情況、電荷變體分布和糖基化譜，發(fā)現(xiàn)無硫胺素補料組的蛋白，完整峰占比、酸堿變體比例、核心糖基化修飾類型，都和對照組高度一致，沒有出現(xiàn)任何異常。

代謝組分析的結(jié)果更能說明問題。補料中移除硫胺素后，胞外硫胺素雖幾乎耗盡，但胞內(nèi)的硫胺素二磷酸（TDP，硫胺素的活性形式）始終能檢測到，直到細胞活力開始下降（圖5）。胞內(nèi)還有硫胺素單磷酸和游離硫胺素，可隨時轉(zhuǎn)化為TDP，滿足細胞能量代謝需求。

圖5 批次補料培養(yǎng)中，胞內(nèi)胞外硫胺素及其磷酸化產(chǎn)物的豐度變化，淺色為無硫胺素補料組，深色為對照組

胞內(nèi)胞外的代謝組整體也無顯著差異，僅有少量硫胺素衍生產(chǎn)物的豐度發(fā)生變化，其余代謝通路均未受影響（圖6）。這說明基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硫胺素，已經(jīng)足夠支撐整個批次補料培養(yǎng)過程，補料中額外添加完全沒有必要。

圖6 有無硫胺素補料時，胞內(nèi)胞外差異代謝特征物的豐度變化及分類

五、研究啟示：精簡補料，從移除非必需不穩(wěn)定成分開始

做這個研究的初衷，是想解決高濃度補料的穩(wěn)定性問題，沒想到最終得出了一個更簡單的結(jié)論：直接把硫胺素從補料中移除。其實細想，這也符合細胞培養(yǎng)的基本邏輯，維生素作為輔酶，細胞的需求量本就極低，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含量已能滿足。

工業(yè)生物制造中，補料的室溫穩(wěn)定性、成分精簡性，直接關(guān)系到生產(chǎn)成本和工藝穩(wěn)定性。硫胺素這類易降解、易發(fā)生相互作用的成分，若并非必需，移除就是最優(yōu)解。這比添加穩(wěn)定劑、低溫儲存、分批次配制補料，要簡單得多，也更適合規(guī)模化生產(chǎn)。

當(dāng)然，這個結(jié)論并非適用于所有細胞培養(yǎng)體系，不同的細胞株、不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，可能會有差異。但本次研究提供的思路，值得行業(yè)參考：對補料中的每一種成分，都去驗證其穩(wěn)定性和實際必要性，而非一味按照傳統(tǒng)配方添加。

某種程度上，這也是下一代細胞培養(yǎng)補料的開發(fā)方向——基于實際培養(yǎng)需求，打造成分精簡、性能穩(wěn)定、適配工業(yè)生產(chǎn)的配方。而硫胺素的移除，就是這一思路的一次成功實踐。

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