楊廣宇/李大力合作開發超迷你CRISPR基因編輯器AsCas12f1?M5，實現PAM擴展與體內高效編輯

編輯丨王多魚

排版丨水成文

CRISPR-Cas基因編輯系統已成為生命科學與生物醫藥的核心工具。但常規的 Cas9、Cas12a 由于編碼基因太長，難以被腺相關病毒（AAV）載體高效包裝遞送，長期以來制約了體內基因治療的臨床轉化。

源自 Acidibacillus sulfuroxidans 的AsCas12f1僅由 422 個氨基酸構成，是目前已知分子量最小的 dsDNA 靶向 CRISPR 核酸酶，具備天然 AAV 遞送優勢。但野生型 AsCas12f1 由于 PAM 序列識別非常嚴格，且在哺乳動物細胞中的基因編輯效率極低，嚴重限制了其在疾病相關位點的靶向覆蓋與治療應用。

近日，上海交通大學生命科學技術學院楊廣宇研究員團隊聯合華東師范大學生命科學學院李大力研究員團隊，在Chemical Engineering Journal期刊發表題為：Directed evolution of a miniature Cas12f1 nuclease from Acidibacillus sulfuroxidans for expanded PAM recognition and enhanced nuclease activity 的研究論文。

該研究通過多輪迭代定向進化改造，獲得優勢突變體——AsCas12f1?M5（G57R/M114Y/M157V/S188R/D311K），該變體實現了 PAM 序列識別范圍從 5′?TTR 擴展至 5′?TYN，可編輯基因組位點覆蓋率由 ～4% 提升至 ～15%；且在哺乳動物細胞內核酸酶活性最高提升 11.6 倍；并在小鼠肝臟內實現了 AAV 介導的安全高效的基因編輯，從而為緊湊型 CRISPR 基因編輯工具的臨床治療轉化提供關鍵突破。

改造策略：結構導向半理性設計+ 迭代定向進化

研究團隊基于 AsCas12f1?sgRNA?dsDNA 冷凍電鏡結構，分析 PAM 近端殘基對序列特異性的調控作用，以及 WED–RuvC 二聚界面正電中心溝殘基對 DNA 骨架的穩定作用，共鎖定了 18 個 PAM 互作殘基與 23 個 DNA 結合殘基，旨在弱化堿基特異性氫鍵與范德華力，放松 PAM 序列約束，同時增強非特異性 DNA 骨架靜電結合，提升 DNA 結合與切割效率。

基于大腸桿菌生長偶聯高通量篩選平臺，添加阿拉伯糖誘導 ccdB 基因表達，讓無法切割靶序列的細菌死亡；只有高效識別并切割含目標 PAM 的靶序列的突變體，才能讓細菌存活。經過五輪迭代組合突變，不斷累積優勢突變，最終得到性能最優的AsCas12f1?M5變體。

AsCas12f1?M5體內外性能評估與功能解析

1、PAM 識別范圍顯著擴大

• 野生型：僅識別 5′?TTR（TTA、TTG）；

• M5：穩定識別 8 種 5′?TYN（TTA、TTG、TTC、TTT、TCA、TCC、TCG、TCT），理論可靶向基因組位點由 ~4% 提升至 ～15%，覆蓋范圍擴大 3–4 倍。

2、體外酶切動力學評估

• 對經典 PAM（TTA/TTG）：15–30 min 幾乎完全切割；

• 對非經典 PAM（TTC/TTT/TCN）：野生型幾乎無活性，M5 保持高效酶切動力學參數證實：催化速率與底物結合能力同步提升。

3、HEK293T 細胞內編輯效率評估

研究團隊利用 eGFxxP 報告系統在 HEK293T 細胞中系統評估了 M5 的 PAM 識別與編輯活性：

• 野生型 AsCas12f1 僅在 5′-TTR 位點有效激活 eGFP，在非經典 PAM 位點活性低于 10%。

• M5 在經典 PAM 位點，eGFP 熒光激活提升至 62%–67%；在非經典 PAM 位點活性普遍超 20%，一些靶點位點更是突破 50%。在 TP53、PDCD1、VEGFA、APOB、PRNP、TTR 等多個基因位點中，M5 均表現出廣譜、高效的編輯能力，顯著優于 v5.1、enAsCas12f1、YHAM 等現有變體，證明其 PAM 擴展效果穩定、普適性強。

體內驗證：內源基因組編輯與AAV遞送體內編輯

研究團隊首先在 HEK293T 細胞中，對覆蓋全部 8 種 5′?TYN PAM 的 60 個內源基因組位點進行編輯效率檢測，測定 M5 在全部 5′?TYN 類型 PAM 均實現高效編輯，證實了 M5 的 PAM 擴展能力可穩定作用于真實染色質環境。

另外，在小鼠模型中，研究團隊通過 AAV 遞送系統，將 M5 成功應用于肝臟基因編輯，血清中目標蛋白水平下降 30%，肝臟組織編輯效率高，低劑量即可起效。同時，肝功能、炎癥因子均無異常升高，無明顯肝損傷和免疫反應。這些結果表明，該系統在體內應用場景中具有良好的穩定性與安全性。

科學意義與價值

1、突破 AAV 遞送瓶頸：422 個氨基酸的超小尺寸，單 AAV 即可裝載 M5+sgRNA，無需使用雙 AAV 載體進行拆分遞送。

2、拓寬靶向空間：覆蓋更多致病突變，適配堿基編輯、先導編輯、多重編輯。

3、通用工程化范式：為其他 Cas12f 微型核酸酶改造提供結構指導和篩選流程。

4、臨床價值明確：為肝臟遺傳病、代謝疾病等提供新一代緊湊型編輯工具。

未來研究展望

1、gRNA 結構與化學修飾：進一步提升穩定性與編輯效率

AsCas12f1?M5 的編輯性能仍可通過 gRNA 工程化設計實現再度升級。現有研究已證實，對 gRNA 進行 2′?O?甲基化、硫代磷酸骨架修飾、末端穩定化改造等化學修飾，可顯著增強 RNA 穩定性、抵抗胞內核酸酶降解等，進而提升編輯效率與特異性。研究團隊正在進一步設計開發高穩定性、高靶向效率、低脫靶風險的 gRNA，結合優勢突變體 AsCas12f1?M5，實現核酸酶與 gRNA 的高效協同與精準適配。

2、臨床應用前景：面向體內基因治療的下一代緊湊型工具

AsCas12f1?M5 憑借超小尺寸、廣譜 PAM、高活性、高安全性四大優勢，在臨床基因治療中具備明確轉化價值，可覆蓋更多遺傳病致病位點，尤其適用于肝臟代謝疾病、神經肌肉疾病、眼科遺傳病等，后續研究團隊將進一步推動 M5 向更精準、更安全的臨床級工具邁進。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.176417