基因修飾T細(xì)胞治療產(chǎn)品藥理毒理研究關(guān)鍵考量點(diǎn)及案例分析

基因修飾T細(xì)胞治療如CAR-T和TCR-T細(xì)胞治療，在多個(gè)血液瘤適應(yīng)癥中顯示出不錯(cuò)的藥效。細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床安評(píng)與傳統(tǒng)化藥、生物藥不同，HESI和美國(guó)FDA共同出臺(tái)了一些文件，國(guó)內(nèi)CDE也有相應(yīng)指導(dǎo)原則，對(duì)T細(xì)胞治療產(chǎn)品的非臨床安評(píng)提供了建議。

FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了7款CAR-T產(chǎn)品上市，包括5款CD19 CAR-T，分別是KiTe的YESCARTA（2017）、TECARTUS（2020），Celgene的BREYANZI（2021），諾華的KYMRIAH（2017），Autolus Therapeutics的Aucatzyl（2024）；2款BCMA CAR-T，分別是BMS的ABECMA（2021）、傳奇生物/強(qiáng)生的CARVYKTI（2022）。

基因修飾T細(xì)胞治療產(chǎn)品主要安全性風(fēng)險(xiǎn)包括細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性、on-target/off-tumor作用，脫靶毒性。另外，通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞理論上會(huì)產(chǎn)生外源基因整合相關(guān)的基因組損傷，如基因編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)、載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)、載體重組風(fēng)險(xiǎn)等。體內(nèi)研究方面，監(jiān)管機(jī)構(gòu)不鼓勵(lì)在非相關(guān)動(dòng)物模型中開(kāi)展研究。但由于細(xì)胞治療產(chǎn)品的特性，傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物毒理研究并不適用。所以這類(lèi)基因修飾T細(xì)胞治療非臨床安評(píng)的核心聚焦在評(píng)估靶點(diǎn)的表達(dá)，如on-target/off-tumor作用及為排除脫靶毒性而開(kāi)展的特異性測(cè)試。這些研究高度依賴in silico和in vitro tools。還有一項(xiàng)重要研究工作是整合位點(diǎn)分析，評(píng)估插入突變等風(fēng)險(xiǎn)。

1、靶點(diǎn)表達(dá)及可靠性測(cè)定

T細(xì)胞治療的核心是識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的目標(biāo)抗原，即使豐度比較低的抗原表達(dá)，T細(xì)胞也能有效殺傷。這種高活性、高靈敏度的免疫反應(yīng)，對(duì)靶點(diǎn)的要求很高，以保障最大化產(chǎn)生藥效的同時(shí)，最小化off-tumor和off-target的風(fēng)險(xiǎn)。

On-target/off-tumor：這點(diǎn)比較容易理解，僅在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的靶點(diǎn)少之又少，大部分可用靶點(diǎn)的特點(diǎn)是腫瘤表面高表達(dá)，正常組織低表達(dá)。所以CAR-T細(xì)胞治療的一部分毒性來(lái)自于對(duì)表達(dá)該靶點(diǎn)的正常組織的殺傷。這就需要對(duì)目標(biāo)靶點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行研究。比如Kite Pharma/Gilead的CD19 CAR-T產(chǎn)品YESCARTA開(kāi)展了CD19在正常及惡性B細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)研究、Juno/BMS的CD19 CAR-T產(chǎn)品BREYANZI也用生物信息學(xué)技術(shù)研究了CD19在正常及惡性B細(xì)胞瘤的分布。BMS的BCMA CAR-T產(chǎn)品ABECMA研究了人腫瘤細(xì)胞系、腫瘤組織的BCMA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)超過(guò)41%人多發(fā)性骨髓瘤樣品高表達(dá)BCMA（≥50%細(xì)胞陽(yáng)性）。淋巴瘤樣本中表達(dá)則弱很多，以>30%設(shè)限，無(wú)樣本表達(dá)BCMA。最后，由于CAR-T產(chǎn)品有入腦趨勢(shì)，具備引發(fā)神經(jīng)毒性的可能性，靶蛋白在腦部組織的表達(dá)應(yīng)進(jìn)行研究。

評(píng)價(jià)方法：首先，可以利用生物信息學(xué)/in silico方法，富集目標(biāo)靶點(diǎn)在健康、疾病組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，proteinatlas.org，gtexportal.org，the Cancer Genome Atlas [TCGA]等網(wǎng)站或數(shù)據(jù)庫(kù)可以幫助實(shí)現(xiàn)這一目的。其次，只有干實(shí)驗(yàn)是不充分的，還要考慮“濕數(shù)據(jù)”。可以考慮采用ISH、IHC、FACS等方法檢測(cè)目標(biāo)靶點(diǎn)在真實(shí)健康、疾病樣本中的表達(dá)和分布情況。這里對(duì)檢測(cè)方法的要求很高，需要對(duì)組織樣本來(lái)源和質(zhì)量、對(duì)照設(shè)置、試劑來(lái)源和質(zhì)量、質(zhì)控等給予足夠重視，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)、客觀、可靠。以上比較，適用于CAR-T類(lèi)產(chǎn)品。對(duì)于TCR-T，由于識(shí)別的主要是MHC-Ⅰ遞呈的多肽抗原，需要對(duì)多肽序列進(jìn)行基因組blast比對(duì)，評(píng)估潛在的on-target/off-tumor風(fēng)險(xiǎn)。另外，對(duì)多肽-MHC的在相關(guān)細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況也需要進(jìn)行檢測(cè)。

Off-target：雖然CAR-T的CAR和TCR-T的TCR特異性不錯(cuò)，但由于這類(lèi)細(xì)胞治療產(chǎn)品的高活性，還是要充分表征潛在的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)估是否有其它內(nèi)源性靶點(diǎn)的結(jié)合。畢竟，即使中等或弱結(jié)合，也會(huì)出現(xiàn)不容忽視的毒性。比如，Juno/BMS的CD19 CAR-T產(chǎn)品BREYANZI就考察了CAR與CD19的親和力及特異性。

評(píng)價(jià)方法：對(duì)于TCR-T產(chǎn)品，可以先通過(guò)丙氨酸掃描等方法確定多肽中的TCR核心識(shí)別區(qū)域。然后采用生物信息學(xué)方法鑒定多肽的同源蛋白，即潛在脫靶結(jié)合對(duì)象。另外，也要排除對(duì)不同HLA表型呈遞的不相關(guān)肽的識(shí)別。這點(diǎn)可以采用EBV轉(zhuǎn)染的B細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)然，以上是基于蛋白結(jié)合的方法，如果能采用功能性測(cè)試，如細(xì)胞毒性，作為終點(diǎn)進(jìn)行考察，說(shuō)服力會(huì)更強(qiáng)。對(duì)于CAR-T產(chǎn)品，CAR的結(jié)構(gòu)主要是scFv抗體，可以采用抗體的評(píng)估特異性的方法和技術(shù)，比較常規(guī)，不再贅述。

2、體內(nèi)安全性和活性評(píng)價(jià)模型

對(duì)于化藥、生物藥、寡核苷酸、溶瘤病毒、疫苗等產(chǎn)品，動(dòng)物毒理研究在非臨床安評(píng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。但是，對(duì)于基因修飾的T細(xì)胞治療產(chǎn)品，動(dòng)物毒理研究則面臨著挑戰(zhàn)。主要包括：1）對(duì)動(dòng)物靶點(diǎn)的識(shí)別存在缺陷，比如CAR-T產(chǎn)品中的CAR可能與動(dòng)物無(wú)交叉結(jié)合，TCR-T由于HLA限制性，更是無(wú)法與動(dòng)物種屬中對(duì)應(yīng)的多肽/MHC結(jié)合；2）人源細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)物后會(huì)出現(xiàn)移植物抗宿主、宿主抗移植物的雙向作用；3）采用自體動(dòng)物替代細(xì)胞的技術(shù)可行性問(wèn)題。基于此，即使CAR-T可以識(shí)別食蟹猴中的同靶點(diǎn)，也無(wú)法實(shí)現(xiàn)在該種屬中毒理評(píng)價(jià)的目的。

既然健康動(dòng)物不適用，模型動(dòng)物自然就“備胎”轉(zhuǎn)正，派上用場(chǎng)了。傳統(tǒng)腫瘤藥物，荷瘤鼠模型主要用于藥效評(píng)價(jià)，伴隨粗略看下安全性指標(biāo)如體重、死亡情況等。對(duì)于基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品，動(dòng)物模型在安全性評(píng)價(jià)中正兒八經(jīng)占了“C位”。常用的是采用嚴(yán)重免疫缺陷動(dòng)物，異源移植不同腫瘤模型，既可評(píng)估藥效，也可用于組織分布，還能用于安全性評(píng)價(jià)，“一箭三雕”。

當(dāng)然，動(dòng)物模型用于安評(píng)是存在一些局限性的：1）解決了宿主抗移植物作用，未解決移植物抗宿主反應(yīng)；2）因缺少髓系細(xì)胞，T細(xì)胞治療產(chǎn)品引起的細(xì)胞因子釋放、神經(jīng)毒性預(yù)測(cè)不足，而這些都是這類(lèi)產(chǎn)品臨床常見(jiàn)不良反應(yīng)；3）不同種屬之間蛋白靶點(diǎn)的同源性差異、表達(dá)水平差異、分布差異等決定了動(dòng)物模型用于on-target/off-tumor和off-target評(píng)估方面也需要case by case分析。

3、病毒和非病毒基因遞送系統(tǒng)的安全性

這點(diǎn)主要跟基因組損傷風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。病毒載體通過(guò)將RNA轉(zhuǎn)換為DNA，并整合到靶細(xì)胞染色體中，穩(wěn)定表達(dá)。慢病毒載體是常用載體之一。慢病毒載體的潛在擔(dān)憂是生產(chǎn)過(guò)程中或患者給藥后產(chǎn)生具備可復(fù)制能力的慢病毒（replication-competent lentivirus, RCL）或插入突變引發(fā)的致癌性風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)然，成熟T細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染后的癌變風(fēng)險(xiǎn)比造血干細(xì)胞是要低的。現(xiàn)有臨床研究也未見(jiàn)明確的慢病毒載體與致癌突變間的高風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)，未見(jiàn)基因修飾T細(xì)胞治療產(chǎn)品成瘤報(bào)道。而且，第三代慢病毒載體用self-inactivating 3’ long-term-repeat (LTR) 替代了之前的active LTR，進(jìn)一步降低了癌變風(fēng)險(xiǎn)。

不過(guò)，目前的基因修飾T細(xì)胞治療的發(fā)展趨勢(shì)具備開(kāi)發(fā)活性更強(qiáng)、作用更持久、更有效針對(duì)實(shí)體瘤、同種異體使用等特點(diǎn)。其中，采用核酸酶去敲除特定基因如負(fù)調(diào)控基因，或通過(guò)基因編輯增強(qiáng)整合實(shí)現(xiàn)表達(dá)或功能增強(qiáng)。常用的基因編輯系統(tǒng)包括Zinc Finger Nucleases (ZFNs), CRISPR, TALENs, MegaTALS等。基因編輯有一定的脫靶率，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)新的功能、基因缺失、易位、遺傳毒性及成瘤性，需要謹(jǐn)慎評(píng)估引入的這些風(fēng)險(xiǎn)。

通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)估T細(xì)胞治療的致瘤性不太現(xiàn)實(shí)。體外試驗(yàn)可以通過(guò)考察不加細(xì)胞因子如IL-2情況下，基因修飾T細(xì)胞產(chǎn)品的增殖情況，判斷成瘤風(fēng)險(xiǎn)。不過(guò)，對(duì)于改造后本身增殖能力得以增強(qiáng)，且不依賴細(xì)胞因子的產(chǎn)品，不太適用。嚴(yán)格講，對(duì)于這類(lèi)產(chǎn)品的成瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的實(shí)驗(yàn)手段是缺乏的。

4、監(jiān)管考量

EMA、FDA及NMPA針對(duì)基因治療產(chǎn)品均有指導(dǎo)原則發(fā)布，前面文章列過(guò)詳細(xì)清單，不再贅述。不過(guò)特異性針對(duì)基因修飾T細(xì)胞治療產(chǎn)品尚無(wú)各國(guó)統(tǒng)一的指南。可以參考已經(jīng)獲批上市的7款CAR-T產(chǎn)品的臨床前研究資料。迄今為止，尚無(wú)基因修飾T細(xì)胞治療產(chǎn)品開(kāi)展非人靈長(zhǎng)類(lèi)毒性研究。各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)普遍認(rèn)為，傳統(tǒng)動(dòng)物體內(nèi)毒理研究并不適用于這類(lèi)產(chǎn)品。PMDA更是認(rèn)為伴隨模型動(dòng)物做些臨床觀察就夠了。但還有一點(diǎn)被普遍認(rèn)同，用于檢測(cè)on-target/off-tumor毒性、off-target/off-tumor毒性、不可控增殖、成瘤性（如核型分析）等體外試驗(yàn)是非常有價(jià)值的。

對(duì)于iPSC來(lái)源的T細(xì)胞治療產(chǎn)品，PMDA明確建議需要評(píng)估成瘤風(fēng)險(xiǎn)。NMPA則要求在首次臨床試驗(yàn)前完成致瘤性試驗(yàn)。

由于基因修飾T細(xì)胞產(chǎn)品太新，全球獲批的數(shù)量很少，而且這類(lèi)產(chǎn)品技術(shù)更新非常快，無(wú)論對(duì)于工業(yè)界還是監(jiān)管機(jī)構(gòu)，所積累的背景數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)都是不足的。所以，需要充分與監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行溝通、討論，確定開(kāi)發(fā)策略和方案。

5、案例

下文總結(jié)了FDA批準(zhǔn)上市的4款CD19和1款BCMA CAR-T產(chǎn)品的非臨床研究?jī)?nèi)容。主要研究?jī)?nèi)容聚焦藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)。毒理學(xué)研究開(kāi)展的內(nèi)容很少，以伴隨藥效模型考察為主。另外，整合位點(diǎn)分析通常是需要開(kāi)展的。首先看下4款CD19 CAR-T產(chǎn)品的資料。

再看下1款BCMA CAR-T產(chǎn)品ABECMA的資料。2021年3月26日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了首個(gè)針對(duì)晚期多發(fā)性骨髓瘤患者的個(gè)性化細(xì)胞療法，即百時(shí)美施貴寶公司的ABECMA，用于治療對(duì)至少四種不同類(lèi)型的既往治療方法沒(méi)有應(yīng)答或者治療后復(fù)發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤患者。年治療費(fèi)用約419600美元。多發(fā)性骨髓瘤是一種罕見(jiàn)的血癌，異常漿細(xì)胞在骨髓中累積并在人體許多骨骼中形成腫瘤，使骨髓無(wú)法產(chǎn)生足夠的健康血細(xì)胞，從而導(dǎo)致低血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

ABECMA是一種B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）靶向的基因修飾自體嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法。患者的T細(xì)胞被收集并進(jìn)行基因改造，使其包含有助于靶向和殺死骨髓瘤細(xì)胞的新基因，修飾后的細(xì)胞重新注入患者體內(nèi)。對(duì)ABECMA的臨床前開(kāi)發(fā)內(nèi)容總結(jié)如下。

總結(jié)

基因修飾T細(xì)胞治療產(chǎn)品的臨床前安全性評(píng)價(jià)手段是受限的。目前的研究主要還是以體外手段為主，重點(diǎn)考察on target/off-tumor和off-target的風(fēng)險(xiǎn)，及可能的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。伴隨模型動(dòng)物開(kāi)展毒理測(cè)試實(shí)屬無(wú)奈之舉，可以提供一些信息。安全性評(píng)價(jià)除了用于提示臨床風(fēng)險(xiǎn)外，還用于臨床起始劑量計(jì)算。但與化藥、生物藥不同，細(xì)胞治療產(chǎn)品是活的藥物，臨床遇到靶點(diǎn)蛋白后，會(huì)進(jìn)一步激活、擴(kuò)增，傳統(tǒng)基于臨床前劑量折算臨床起始劑量的方法并不適用。更多的還是參考同類(lèi)產(chǎn)品的劑量，并結(jié)合臨床前數(shù)據(jù)對(duì)該劑量的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。