GLP一般毒理研究試驗(yàn)方案的組成

本文介紹下GLP一般毒理研究（如單次和多次給藥毒性試驗(yàn)）試驗(yàn)方案的組成。主要參考《A Comprehensive Guide to Toxicology in Nonclinical Drug Development》一書中的第6章節(jié)。

1. 遵守良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（GLP）聲明

所有用于評估藥物安全性的一般毒理研究（單次和多次給藥毒性試驗(yàn)）都應(yīng)在GLP條件下進(jìn)行。當(dāng)然，不僅一般毒理研究，生殖毒性（Ⅰ段、Ⅱ段、Ⅲ段）、致癌性、遺傳毒性（如Ames、染色體畸變和小鼠淋巴瘤試驗(yàn)）、局部毒性試驗(yàn)、免疫原性試驗(yàn)、安全藥理學(xué)試驗(yàn)、依賴性試驗(yàn)、毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)等均需要在GLP認(rèn)證通過的機(jī)構(gòu)開展。所以，在試驗(yàn)方案中需要包含GLP依從性聲明。這點(diǎn)看似普通，直至現(xiàn)在，依然有企業(yè)在這塊吃虧。有的企業(yè)，最初申報(bào)IND時(shí)，僅計(jì)劃在國內(nèi)開展臨床研究，故方案中參照的GLP法規(guī)僅體現(xiàn)了NMPA《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》，后期開發(fā)過程中，想用該數(shù)據(jù)申報(bào)美國或其它法規(guī)國家，因方案中未聲明遵守目標(biāo)國家的GLP法規(guī)情況，遭到拒絕。

2. 計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)

用于數(shù)據(jù)生成、測量或評估的計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)，應(yīng)按照符合GLP原則的方式進(jìn)行開發(fā)、驗(yàn)證、操作和維護(hù)。

3. 委托方信息、研究機(jī)構(gòu)信息、專題名稱、研究目標(biāo)

方案中應(yīng)體現(xiàn)委托方、GLP機(jī)構(gòu)、專題名稱、專題代號等信息。

研究目標(biāo)：根據(jù)產(chǎn)品具體適應(yīng)癥和類型，一般毒理研究的目標(biāo)有很多，比如確定“未觀察到不良效應(yīng)水平（NOAEL）”；描述重復(fù)給藥后的劑量-效應(yīng)關(guān)系；確定并描述重復(fù)給藥后受影響的特定靶器官、恢復(fù)情況；為更長周期重復(fù)給藥毒理研究提供劑量設(shè)計(jì)依據(jù)。

4. 受試物

毒性研究中使用的受試物應(yīng)是申請人計(jì)劃在人體臨床試驗(yàn)中使用的同一物質(zhì)。如果可能，整個(gè)研究應(yīng)使用同一批次的受試物。如果單一批次無法完成研究，則應(yīng)使用純度和組成相似的批次。

關(guān)于這點(diǎn)，大部分企業(yè)會選擇制備兩批次樣品，一批non-GMP毒理批樣品，一批GMP臨床批樣品，顧名思義，前者主要用于支持非臨床毒理研究的開展，后者則用于臨床試驗(yàn)。當(dāng)然，兩批次樣品質(zhì)量肯定要具備可比性的。

5. 鑒別、組成和純度

應(yīng)明確受試物的鑒別、組成和純度，包括所有主要成分的名稱和含量、已知雜質(zhì)和污染物以及不可識別成分的百分比。

6. 儲存條件和有效期

受試樣品應(yīng)儲存在能夠維持其穩(wěn)定的條件下，直至研究完成。受試物的有效期應(yīng)明確，不得使用超過有效期的受試物。

7. 試驗(yàn)系統(tǒng)和飼養(yǎng)管理

對于大多數(shù)藥品，通常需要兩種種屬進(jìn)行毒理研究：嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物。

大多數(shù)國家都有關(guān)于動(dòng)物的護(hù)理、維護(hù)和飼養(yǎng)的建議和法律要求，這些要求在所有GLP中都被明確規(guī)定。

以下是一些關(guān)于研究中動(dòng)物使用方面的國際政府法規(guī)/指南的簡要列表：

美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）出版物85e23，《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》

《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》第八版（NRC 2011）

歐洲保護(hù)用于實(shí)驗(yàn)和其他科學(xué)目的的脊椎動(dòng)物公約：ETS 123附錄A；關(guān)于用于科學(xué)目的的動(dòng)物保護(hù)的指令2010/63/EU

日本科學(xué)委員會2006年6月1日發(fā)布的《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)正確操作指南》

動(dòng)物福利法7 Usc 2131等（PL 89e544，1966年8月24日；修正案PL 91e579，1970年12月24日；修正案PL 94e279，1976年4月22日；修正案PL 99e198，1985年12月23日）

8. 物種、品系、性別和數(shù)量的選擇

試驗(yàn)方案中應(yīng)給出物種、品系、性別和動(dòng)物數(shù)量選擇的理由。

如果研究中僅使用一種性別，則應(yīng)根據(jù)預(yù)期的臨床用途或既往數(shù)據(jù)進(jìn)行合理說明。在大多數(shù)毒理研究中，應(yīng)同時(shí)使用雄性和雌性動(dòng)物。

所有試驗(yàn)動(dòng)物必須健康，且未接受過任何的事先實(shí)驗(yàn)操作。

9. 動(dòng)物年齡和標(biāo)識

在嚙齒類動(dòng)物中，毒理試驗(yàn)通常從6到8周齡開始。在非嚙齒類動(dòng)物中，毒理試驗(yàn)通常在動(dòng)物接近性成熟時(shí)開始（非人靈長類動(dòng)物除外）。NMPA《重復(fù)給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》明確規(guī)定，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)期限和臨床擬用人群確定動(dòng)物年齡，一般大鼠為6～9周齡，Beagle犬6～12月齡，猴3～5歲，動(dòng)物年齡應(yīng)盡量接近，應(yīng)注明開始給藥時(shí)動(dòng)物年齡。關(guān)于猴年齡問題，F(xiàn)DA申報(bào)資料中低于3歲的動(dòng)物用于一般毒理研究并不罕見，但國內(nèi)監(jiān)管機(jī)構(gòu)對這一細(xì)節(jié)更加關(guān)注，前幾年也因?yàn)槭褂玫湍挲g段動(dòng)物，出現(xiàn)過風(fēng)波，所以現(xiàn)在各機(jī)構(gòu)已經(jīng)很注意動(dòng)物年齡的合規(guī)性。

試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行個(gè)體標(biāo)識，其飼養(yǎng)環(huán)境也應(yīng)標(biāo)明其物種、品系（和亞品系）、性別、年齡和唯一標(biāo)識號碼（例如耳標(biāo)、植入式標(biāo)識芯片和動(dòng)物紋身標(biāo)識）。

10. 動(dòng)物隨機(jī)化

動(dòng)物應(yīng)以分層隨機(jī)的方式分配到對照組和供試品組，以盡量減少偏差，并確保供試品處理組和對照組之間相關(guān)變量的可比性（如平均體重和體重范圍）。

如果使用其他特征作為隨機(jī)化的依據(jù)，則應(yīng)進(jìn)行描述和合理說明。

盡可能在同一天將動(dòng)物納入研究。如果動(dòng)物數(shù)量過多而無法在一天內(nèi)完成分配，則可以在幾天內(nèi)分批將動(dòng)物納入研究，但每天應(yīng)將相等比例的對照動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物納入研究，以保持同時(shí)性。

11. 基礎(chǔ)飲食

在毒理研究中，應(yīng)為動(dòng)物提供自由采食和飲水，且這些研究的飼料應(yīng)滿足物種正常生長和繁殖的營養(yǎng)需求。

除非有特殊情況需要其他安排，否則應(yīng)確保受試物處理組動(dòng)物的飼料與對照組動(dòng)物的飼料具有相同的熱量密度，并且含有相同水平的營養(yǎng)成分（例如纖維、微量營養(yǎng)素）。

12. 對照組和供試品組

需要設(shè)置一個(gè)與受試動(dòng)物同時(shí)進(jìn)行的對照組。

應(yīng)給予對照動(dòng)物與受試物相同的載體或溶劑，其體積應(yīng)與任何給藥組動(dòng)物所接受的最大載體或溶劑體積相等。

應(yīng)有足夠的毒理學(xué)信息來確保所使用的載體或溶劑不會影響研究結(jié)果。如果關(guān)于用于施用受試物的載體或溶劑的毒性信息不足，則應(yīng)增加一個(gè)未暴露于載體或溶劑的額外對照組。

其他方面，對照組動(dòng)物應(yīng)與給藥組動(dòng)物接受相同的處理。

至少應(yīng)設(shè)置三個(gè)劑量水平（加上同時(shí)進(jìn)行的對照組），給藥途徑應(yīng)與人體預(yù)期暴露途徑相同，最低劑量應(yīng)無明顯毒性，最高劑量應(yīng)產(chǎn)生明顯的毒性，表現(xiàn)為以下情況：

死亡或發(fā)病（不推薦作為終點(diǎn)，但可以使用）；飼料消耗量變化；體重變化；毒性體征；臨床病理學(xué)；組織病理學(xué)

13. 恢復(fù)期組

在至少一項(xiàng)毒理學(xué)研究中，通常需要進(jìn)行恢復(fù)期評估，即在給藥階段結(jié)束后增加一個(gè)非暴露期，專門用于確定任何與受試物相關(guān)的毒理發(fā)現(xiàn)的潛在可逆性。

14. 給藥途徑和持續(xù)時(shí)間

受試物的給藥途徑應(yīng)盡可能接近人體正常暴露途徑。如果使用其他途徑，則應(yīng)提供理由。在整個(gè)研究中，所有試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)使用相同的給藥方法。

除非有藥理學(xué)證據(jù)表明每日給藥并無必要，或者這不是人體預(yù)期給藥方案（如某些生物藥物半衰期長，給藥間隔久），否則動(dòng)物應(yīng)每日暴露于受試物。

給藥周期視臨床擬用方案而定，具體可參見ICH M3。

15. 體重和飼料攝入數(shù)據(jù)

試驗(yàn)動(dòng)物每周至少稱重一次。

在亞慢性毒性研究期間，每周應(yīng)測量飼料消耗量（如果受試物通過飲用水給藥，則測量飲水量）。

16. 臨床觀察

應(yīng)進(jìn)行眼科檢查、血液學(xué)分析、臨床生化檢測和尿液分析。不曉得為什么該書會將這些指標(biāo)納入Clinical Observations，尊重原作，保留原文內(nèi)容（下文會逐一介紹）。不過，除了以上指標(biāo)，體溫、血壓、心電圖等也是常規(guī)毒理檢測終點(diǎn)指標(biāo)，正常情況下，在方案中也要體現(xiàn)。

17. 毒代動(dòng)力學(xué)

應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)暴露評估，以確認(rèn)給藥劑量與血藥濃度的關(guān)系，評估劑量比例關(guān)系，比較急性暴露與重復(fù)暴露之間的潛在差異，評估蓄積/飽和動(dòng)態(tài)，并確定是否存在性別差異。

18. 免疫原性

抗藥物抗體的評估適用于生物藥物、多肽或寡核苷酸等藥物形式，這些分子足夠大，可能引發(fā)免疫反應(yīng)。

這些評估在一般毒理研究中的主要目的是確定抗藥抗體是否可能改變其暴露特征，從而改變一般毒性判定中的系統(tǒng)暴露標(biāo)準(zhǔn)。

在進(jìn)行重復(fù)給藥毒性研究時(shí)，應(yīng)測量與這些產(chǎn)品相關(guān)的抗體，以幫助解釋毒理研究結(jié)果。抗體反應(yīng)應(yīng)進(jìn)行特征分析，并與藥理學(xué)和/或毒理學(xué)變化相關(guān)聯(lián)。

在解釋研究結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮抗體形成對藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)參數(shù)、不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度、補(bǔ)體激活或新毒性效應(yīng)出現(xiàn)的影響。

19. 免疫毒性

免疫毒性參數(shù)的評估采用分層方法進(jìn)行。初步評估包括標(biāo)準(zhǔn)臨床病理學(xué)和病理學(xué)。如果這些評估的數(shù)據(jù)表明對免疫系統(tǒng)可能存在影響，則需要進(jìn)一步評估。

當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)非臨床毒性研究中觀察到免疫抑制的證據(jù)，例如骨髓抑制、全血細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞減少或其他血液異常，或免疫系統(tǒng)器官重量和組織學(xué)改變（例如，胸腺、脾臟、淋巴結(jié)或骨髓等免疫系統(tǒng)組織的低細(xì)胞性），或腫瘤發(fā)生率增加時(shí)，可能需要額外的研究（例如免疫表型和功能檢測），以確定在暴露于受試物后，免疫系統(tǒng)是否受到損害。

免疫毒性要區(qū)分非預(yù)期的（不良的）免疫抑制效應(yīng)和預(yù)期的（藥效學(xué)）效應(yīng)。比如，抗腫瘤藥物對快速分裂細(xì)胞具有毒性，這是一個(gè)預(yù)期的終點(diǎn)，在這種情況下不應(yīng)被視為不良反應(yīng)。另一個(gè)例子是，如果藥物用于治療實(shí)體瘤，由于骨髓毒性導(dǎo)致的免疫抑制被認(rèn)為是不良事件，但如果藥物旨在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤，則不一定被視為不良事件。

20. 血液學(xué)

以下檢測項(xiàng)目建議用于評估血液學(xué)變化：

血細(xì)胞比容、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度

凝血能力檢測（如凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、血小板計(jì)數(shù)等）

受試化合物可能會影響造血系統(tǒng)，因此應(yīng)采取適當(dāng)措施，確保在必要時(shí)可以進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓細(xì)胞學(xué)評估。應(yīng)使用自動(dòng)化網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)功能或空氣干燥血涂片為每只動(dòng)物進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。應(yīng)為每只動(dòng)物制備骨髓涂片以評估骨髓細(xì)胞學(xué)。只有在觀察到對造血系統(tǒng)的影響時(shí)，才需要對這些涂片進(jìn)行顯微鏡檢查。

21. 臨床生化

應(yīng)采集血液樣本以進(jìn)行臨床化學(xué)檢測，包括電解質(zhì)平衡、碳水化合物代謝以及肝腎功能的測量。具體檢測項(xiàng)目應(yīng)包括：

肝細(xì)胞評估：至少選擇以下五項(xiàng)中的三項(xiàng)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（SGPT，ALT）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（SGOT，AST）；山梨醇脫氫酶；谷氨酸脫氫酶；總膽汁酸。

肝膽評估：至少選擇以下五項(xiàng)中的三項(xiàng)，堿性磷酸酶；膽紅素（總）；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）；5'-核苷酸酶；總膽汁酸。

其他細(xì)胞變化或細(xì)胞功能的標(biāo)志物：白蛋白、鈣、氯、膽固醇（總）、膽堿酯酶、肌酐、球蛋白（計(jì)算值）、葡萄糖（禁食動(dòng)物）、磷、鉀、蛋白質(zhì)（總）、鈉、甘油三酯（禁食）、尿素氮

然而，如果無法從試驗(yàn)動(dòng)物中獲得足夠的血液量，則以下檢測項(xiàng)目通常應(yīng)優(yōu)先考慮：

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、氯、肌酐、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、葡萄糖（禁食動(dòng)物）、鉀、蛋白質(zhì)（總）、鈉、尿素氮

22. 尿液分析

應(yīng)測定尿液量、比重、pH值、葡萄糖和蛋白質(zhì)，并對尿液進(jìn)行顯微鏡檢查，以評估尿沉渣和血液/紅細(xì)胞的存在。

23. 尸檢和顯微鏡檢查

大體尸檢：所有試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行完整的肉眼檢查，包括檢查外部表面、孔口、顱腔、胸腔和腹腔、尸體及所有器官。

器官重量：應(yīng)稱量腎上腺、大腦、附睪、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、睪丸、甲狀腺/甲狀旁腺、胸腺、卵巢和子宮的重量。應(yīng)仔細(xì)解剖并去除脂肪和其他鄰近組織后立即稱重，以盡量減少干燥對器官重量的影響。

組織制備用于顯微鏡檢查：組織應(yīng)在10%緩沖甲醛（或其他公認(rèn)的固定劑）中固定，并制備切片，用蘇木精和伊紅（或其他適當(dāng)染色劑）染色，以備顯微鏡檢查。肺部應(yīng)在浸泡于固定劑之前用固定劑充氣。

顯微鏡評估：所有肉眼可見的病變應(yīng)進(jìn)行顯微鏡檢查。對照組和高劑量組的所有組織應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。如果在某些組織中觀察到與給藥相關(guān)的效應(yīng)，則應(yīng)檢查這些特定組織的下一個(gè)較低劑量水平。如果在下一個(gè)較低劑量水平中仍觀察到效應(yīng)，則繼續(xù)檢查下一個(gè)較低劑量水平，直到未發(fā)現(xiàn)效應(yīng)為止。此外，所有提前死亡或在研究期間被處死的動(dòng)物的組織應(yīng)進(jìn)行顯微鏡檢查，以評估任何潛在的毒性效應(yīng)。進(jìn)行組織病理學(xué)檢查的組織如下：

腎上腺、主動(dòng)脈、骨（股骨）、骨髓（胸骨）、大腦（至少三個(gè)不同水平）、盲腸、結(jié)腸、子宮體和子宮頸、十二指腸、附睪、食管、眼睛、膽囊（如果存在）、哈德氏腺（如果存在）、心臟、回腸、空腸、腎臟、肝臟、肺（帶主支氣管）、淋巴結(jié)（一個(gè)與給藥途徑相關(guān)，一個(gè)來自遠(yuǎn)端位置）、乳腺、鼻甲、卵巢和輸卵管、胰腺、垂體、前列腺、直腸、唾液腺、坐骨神經(jīng)、精囊腺（如果存在）、骨骼肌、皮膚、脊髓（三個(gè)位置：頸椎、中胸椎、腰椎）、脾臟、胃、睪丸、胸腺（或胸腺區(qū)域）、甲狀腺/甲狀旁腺、氣管、膀胱、陰道及其它所有異常組織。

24. 供試品分析

若供試品需經(jīng)溶解后（混合、混懸、溶解）給藥，應(yīng)提供供試品在溶劑中的穩(wěn)定性、均一性（非溶液體系）等檢測報(bào)告（濃度范圍需能覆蓋全部毒理試驗(yàn)的濃度范圍），以及配制后的供試品濃度分析報(bào)告。

25. 質(zhì)量保證

方案中通常需要體現(xiàn)質(zhì)量保證部門介入的內(nèi)容。

26. 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)是判定毒理發(fā)現(xiàn)是否有意義的重要工具，故方案中需要明確擬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)方法等。

其中，供試品分析、質(zhì)量保證、統(tǒng)計(jì)分析部分在原文中并未包括，筆者根據(jù)情況自行添加，僅供大家參考。

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