河南大學謝啟光/徐小冬團隊揭示植物生物鐘TTFLs存在新調控機制

植物時間生物學（生物鐘）旨在從分子細胞水平揭示內源計時機制及其如何賦予植物更強的環境適應性。生物鐘在作物引種馴化、高光效、抗逆性、高產穩產、水肥和農藥高效利用等方面有著廣闊的應用前景。迄今為止，該領域建立的植物生物鐘多重轉錄-翻譯反饋環路（transcription–translation feedback loops, TTFLs）模型依然處在不斷完善過程之中，特別是生物鐘如何精確維持近24小時節律及關鍵組分時間特異性表達的生物學意義是領域內備受關注的科學問題，亟待深入研究。

PRR（PSEUDO-RESPONSE REGULATOR）作為植物生物鐘核心組分，在從低等到高等植物進化中拷貝數大幅增加，其在模式植物擬南芥中共有5個拷貝和1個假基因，從清晨到傍晚約2小時間隔依次節律性表達，形成“五重奏”現象。PRRs-CCA1/LHY模塊在生物鐘穩態調控中發揮著核心作用，以PRRs為突破口研究時間特異性轉錄調控有助于深入理解生物鐘TTFLs調控機制及其如何增強植物環境適應能力。

近日，河南大學謝啟光和徐小冬教授研究團隊在期刊Plant,Cell& Environment發表了題為“Cis-Regulatory Architecture of PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 9 and Its Role in the Integration of the Plant Circadian Clock andEnvironmentalSignalling”的論文，該研究表明目前有關生物鐘清晨或傍晚轉錄復合體決定PRR9節律性表達的模型需要重新審視：PRR9節律表達取決于一段此前未被表征的27 bp啟動子序列，該序列不含任何已知生物鐘相關基序。該發現挑戰了“僅由生物鐘相關順式作用元件決定生物鐘基因節律表達”的普遍觀點；同時證明了PRR9在轉錄水平時間特異性響應光照和溫度信號可能有助于植物獲得生長優勢。

本研究利用啟動子逐段敲除、定點誘變，構建了一系列PRR9啟動子驅動的LUC報告基因來鑒定對光、溫度、晝夜和近日節律調控有響應的順式元件。首先，通過系統性缺失法，作者構建了啟動子5'-端截短突變體，以鑒定在晝夜節律和生物鐘條件下影響轉錄豐度與節律性的片段。構建轉基因擬南芥株系后，篩選足夠數量的純合植株進行生物發光分析。每種構建體從約24株隨機篩選的轉基因植株中，至少選取三株具有代表性LUC強度和節律表型的純合植株進行后續實驗。高靈敏度CCD相機生物發光成像揭示：PRR9轉錄強度受上游啟動子片段調控。刪除?611至?952 bp區域（命名為F24片段）顯著降低了LUC活性（圖1b、c），表明該區域具有轉錄增強子功能。

圖1. PRR9基因啟動子區含有順式作用元件，可調控其自身轉錄豐度、晝夜節律性及光響應。

為解決這一問題，作者對PRR9啟動子進行了詳細分析，以識別對節律性轉錄至關重要的區域。先前研究表明，將PRR9啟動子的F24片段與D8片段融合后，既能恢復LUC信號強度又能恢復節律性——盡管F24本身是通用轉錄增強子而非節律決定因子。這表明D8片段（-1至-362 bp）在PRR9節律性中起關鍵作用——該區域雖含一個EE位點和兩個SORLIP位點，卻缺乏其他已知的晝夜節律順式作用元件。然而，其他啟動子區域是否參與調控仍不明確。先前研究發現?277至?396 bp區域對PRR9在晝夜節律周期中的節律性至關重要，但具體負責該功能的序列尚未確定。為深入探究，作者系統性地刪除特定啟動子片段，同時保留完整PRR9啟動子以避免對轉錄豐度產生干擾效應（圖2a）。生物發光成像顯示，D10和D11構建體在LD、LL及CC條件下均保持節律性，而D12和D13則呈現無節律表型（圖2b、d、f）。結合圖1數據，這些結果精準定位了?233至?391 bp區域對PRR9晝夜節律至關重要。該160 bp區域包含SORLIP和EE基序。為進一步縮小調控PRR9節律性表達的啟動子序列范圍，作者敲除了這段約160 bp區域。D15構建體（移除SORLIP1/2及其側翼區域）仍保持節律性表達，而D17構建體（剔除-272至-246 bp片段，不含EE基序及其上游四個核苷酸）則導致表達失調（圖2c、e、g）。這些發現鑒定出一個新型27 bp順式作用元件（5′-TATACAACAAAGTCTTCTTCTTTCTCT-3′），該元件對光照和溫度同步條件下PRR9的節律性轉錄至關重要。值得注意的是，該序列不含任何已知的經典晝夜節律順式作用元件。

圖2. 新型27 bp順式作用元件調控PRR9的近日節律性。

該研究推測PRR9對光的響應可能由多個轉錄因子結合多個位點來調控。研究結果表明，PRR9對溫度的響應主要通過位于其啟動子上游較遠位置的HSF結合位點介導，并受晝夜節律時鐘的調控。先前的研究表明，PRR7也通過 HsfB2b 受熱調控。作者認為，這證明從溫度響應的角度來看，PRR9和PRR7在很大程度上具有功能互補性。進一步的研究結果表明，PRR9對光敏感，這可能與其參與重置生物鐘有關。自然界中生長的植物每天都會經歷光周期的逐漸變化，而光可調控的生物鐘對于生長發育階段的光周期響應至關重要。作者初步證明PRR9參與了光對生物鐘的重置（圖3），并且可能也參與了溫度對生物鐘的重置。

圖3. PRR9的時空特異性表達賦予其特定生理功能。

河南大學生命科學學院/作物逆境適應與改良國家重點實驗室的謝啟光、徐小冬教授為論文共通訊作者，在讀博士生劉玉潔、特聘教授劉明明博士為論文第一作者，在讀研究生王曉雨、連夢麗、已畢業研究生宋佳麗、丁立煥參與了該項研究；團隊在生物鐘領域的相關研究得到了國家自然科學基金項目、十四五重點研發項目、河南省科技創新領軍人才、河南大學雙一流建設學科經費的支持。

通訊作者謝啟光教授，武漢大學發育生物學專業理學博士；美國加州大學河邊分校、美國范德堡大學、美國達特茅斯學院副研究員；現任河南大學省部共建作物逆境適應與改良國家重點實驗室課題組長、教授、博士生導師。入選河北省“百人計劃”、省級特聘專家、現任中國細胞生物學學會生物節律分會常務委員。課題組研究方向為“作物生物鐘與重要農藝性狀調控機理”：側重于闡明植物/作物生物鐘多重轉錄-翻譯反饋環路的分子機理，同時力圖揭示作物生物鐘調控栽培地域性和脅迫抗性的機制。入選河北省“百人計劃”、省級特聘專家、現任中國細胞生物學學會生物節律分會常務委員。累計發表近50篇學術及專著文章，其中以通訊或第一作者身份在Plant Cell、PNAS、Nature Communications、Plant Cell Environ、J Integr Plant Biol、Theor Appl Genet等期刊發表論文20余篇；成果并多次被本領域同行的綜述文章所引用，其中涉及生物鐘新組分和新機制的內容，包括LNK1/2、BBX18/19、COR27/28、SKIP等已經繪入植物生物鐘領域工作模型之中。

https://doi.org/10.1111/pce.70293