動物行為實驗總結丨不同神經記錄下的清醒小鼠頭部固定的范式應用

清醒小鼠頭部固定是一種常用技術用于在動物保持清醒狀態下進行高精度的神經記錄（如雙光子成像、虛擬現實、寬場成像、在體電生理記錄等），同時避免運動偽影。

多電極陣列（如Neuropixels探針）能夠以高時間分辨率對大量單個神經元進行電生理記錄。通過使用這類探針可在同一動物體內同時測量功能上相互關聯但解剖位置不同的多個腦區的神經活動。然而，在小鼠等小型動物中使用多個探針需要移除相當大一部分顱骨，同時必須盡量減少組織損傷并在記錄過程中保持大腦穩定。

Fig1 頭架與顱骨開窗植入術

顱骨開窗：

選項 A（急性記錄）：暫不開窗，僅預留區域，記錄當天再開。

選項 B（慢性窗口）：

在頭架中央開口內，用精細顱骨鉆（<0.5 mm）緩慢磨出一個大范圍薄層顱骨窗（如 4×4 mm2），或多個小孔（用于多探針）。接近硬腦膜時改用鑷子或針尖輕柔剝離殘余骨片，避免損傷硬腦膜或引起出血。若需長期成像，可保留完整硬腦膜；若用于電極插入，可小心移除。

Neuropixels 多探針清醒小鼠記錄

階段一：頭架與可拆卸玻璃蓋片植入

術前準備：

小鼠（通常為成年 C57BL/6 或轉基因品系）經適應性訓練，熟悉抓握和輕度約束。術前給予鎮痛藥（如布洛芬或卡洛芬）和抗生素。使用異氟烷維持麻醉，配合眼膏防干。

立體定位手術：

固定小鼠于立體定位儀，剃毛、消毒頭皮。沿中線切開皮膚，剝離筋膜，暴露顱骨。清理顱骨表面（H?O? 或生理鹽水），確保干燥無出血。

頭架固定：

使用牙科水泥將定制金屬或3D打印頭架牢固粘附于顱骨（覆蓋頂骨及部分額骨）。

頭架中央預留一個大開口（直徑約 8–10 mm），用于后續多探針插入。

植入可拆卸玻璃蓋片：

在頭架開口處覆蓋一塊圓形玻璃蓋片，用少量快速固化膠（如 UV 膠）臨時固定。蓋片可在記錄前移除，避免阻礙探針插入。

術后恢復：

縫合皮膚邊緣，給予術后鎮痛 48–72 小時。恢復期 ≥7 天，并進行清醒頭部固定適應訓練（每天 10–30 分鐘，持續 3–5 天）。

階段二：探針精確定位與成像窗口安裝（記錄當天）

移除玻璃蓋片：

輕柔取下臨時玻璃蓋片，暴露完整顱骨窗區域。

顱骨開窗（關鍵步驟）：

使用精細顱骨鉆（<0.5 mm tip）在目標腦區上方小心磨薄或打孔（通常 4–6 個孔，直徑 0.5–1 mm），避開主要血管。孔位根據目標腦區坐標預先設計。用 PBS 沖洗碎屑，保持硬腦膜完整（或輕柔移除）。

安裝帶孔塑料成像窗口：

放置一個定制的帶孔塑料環（如聚醚醚酮 PEEK 或 Delrin 材料），孔位與探針路徑對齊。該窗口可穩定腦組織、減少腦搏動，并防止探針插入時腦脊液流失。

腦聲常談建立了多個《動物模型構建與行為評估》交流群，群內分享各種經典和前沿的行為范式，共同交流解決動物實驗中遇到的棘手問題，避坑少走彎路！有需要的老師可以掃碼添加微信進入討論群！

階段三：清醒狀態下探針插入與記錄

頭部固定：

將小鼠輕柔放入行為裝置，用頭架夾具固定頭部，身體置于泡沫墊或跑步球上。

探針裝載與定位：

將最多 6 根 Neuropixels 探針（如 NP 1.0 或 2.0）裝載到高精度微操縱器

通過顯微鏡或攝像頭對準顱骨開孔，緩慢下降探針至硬腦膜表面。

探針插入：

以 10–50 μm/s 的速度緩慢插入探針至目標深度。插入過程中小鼠應保持安靜（可通過獎勵或習慣化實現）。

電生理記錄：

連接探針開始采集寬頻信號（通常 30 kHz 采樣率）。同步記錄行為視頻、跑步球運動、視覺刺激等。

階段四：數據質量控制與探針回收

實時監測噪聲水平、單位數量、LFP 特征，確保信號質量。記錄結束后緩慢回撤探針，清潔并妥善保存。

關鍵優化點：

顱骨開窗面積大但精準：平衡多探針通路與腦穩定性。

硬腦膜處理：保留可減少炎癥，移除可降低插入阻力，需根據經驗選擇。

清醒適應訓練：小鼠必須平靜。

虛擬現實模擬相關范式

頭部固定小鼠能夠實現對神經元活動的高分辨率監測并結合對環境刺激的精確控制。虛擬現實可用于在頭部固定狀態下模擬運動時的視覺體驗，而一種低慣性的、可浮動的真實物理環境即“移動家園籠”（Mobile Home Cage, MHC）可調動更多感官模態，為復雜行為任務提供更豐富的實驗場景。

Fig2 基于氣浮技術的清醒行為記錄系統

(a) 頭部固定裝置：氣浮支撐的碳纖維容器置于空氣分配平臺上的頭部固定橋下方。

(b) 頭部固定裝置示意圖（左）：小鼠頭部被固定在橋上，但可通過自身運動帶動下方容器自由移動；實際照片顯示裝有泡沫T型迷宮插件的容器（右）。

(c) 小鼠在從飼養籠轉移至頭部固定裝置過程中，用法蘭絨布包裹以減少應激。

(d) 頭部固定夾持器以37°傾角安裝，符合小鼠自然姿勢。

(e) 連續多日限水對小鼠體重的影響：藍色表示自由飲水期，灰色表示限水期。

(f) 在連續多日的15分鐘實驗中，每只小鼠完成的試驗次數（即圓形跑道的圈數）

采用立體定位手術在實驗前一周為小鼠植入頭件。手術中，小鼠經異氟烷麻醉后固定于立體定位儀，在Bregma與Lambda之間切開皮膚暴露顱骨，用3%過氧化氫清潔表面并以Vetbond膠將皮膚邊緣固定于顱骨以減少術后收縮。隨后輕劃顱骨以增強粘附力。在背側海馬上方鉆取直徑1.5 mm的顱骨開窗電生理實驗中該窗口以瓊脂封堵；最后，以牙科丙烯酸樹脂將頭板及導管整體穩固于顱骨。術后小鼠先單籠飼養48小時，再恢復至常規雙籠環境繼續休養3–5天。從術后第5天起，開始為期數日的清醒頭部固定適應訓練。每日進行15分鐘手法接觸：通過籠內熟悉的紙筒隧道溫和取出小鼠，用手掌托持并允許其探索；隨后將其放入Mobile Home Cage（MHC）系統的碳纖維圓形arena中自由活動5分鐘。當小鼠能主動返回實驗員手掌后，次日引入轉移布巾訓練將其置于布巾上反復包裹/展開數次（每次<20秒）。達到穩定配合后，正式進入頭部固定階段：小鼠被布巾包裹后置于MHC系統中，該系統由鋁制支架和氣浮支撐的超輕碳纖維容器（直徑34 cm）組成。頭板被夾緊于頭柱，移除布巾后啟動空氣壓縮機（噪音約50 dB），調節氣壓使平臺懸浮高度剛好容許一張紙通過。實驗中可通過更換泡沫插件切換跑道構型（如圓形或T迷宮）并在周圍設置條紋、斑點等視覺線索輔助空間定位。所有頭部固定實驗連續多日進行，單次時長不超過20分鐘，確保動物在清醒、低應激狀態下完成神經記錄或行為任務。

雙光子成像中小鼠頭部固定

對清醒小鼠在雙光子顯微鏡下的高分辨率、長期穩定成像：

1. 頭架手術植入

成年小鼠（8–12周齡）經異氟烷麻醉后，固定于立體定位儀。沿顱骨中線切開皮膚，將定制鈦合金頭板（其連接桿位于顱骨后方并抬高，避免遮擋小鼠±59.3°水平與±47°垂直視野）以快干膠初步粘附，并用牙科丙烯酸樹脂牢固固定于頂骨與額骨。若需長期成像，在目標腦區（如視覺皮層或海馬）上方鉆取直徑約3–5 mm的顱骨開窗，小心保留或移除硬腦膜，并覆蓋玻璃蓋片密封。術后給予鎮痛藥，單籠恢復48小時后轉為常規飼養，恢復期不少于5天。

2. 清醒適應與行為訓練

從術后第5天起，每日進行10–15分鐘的溫和接觸與頭部固定適應訓練：通過隧道或手掌轉移小鼠，逐步引入包裹布巾和碳纖維跑輪環境，使其在無應激狀態下習慣被固定于頭柱上并能在低慣性跑輪上自由運動。訓練持續3–5天，直至小鼠在固定狀態下呼吸平穩、主動探索且無掙扎行為。

3. 頭部固定與雙光子成像對準

實驗當日，將小鼠輕柔包裹后置于雙光子顯微鏡的行為平臺，通過夾具將頭板牢固夾持于預校準的頭柱上。系統采用統一的“小鼠–屏幕”幾何構型確保刺激顯示器位于標準視角范圍內。為實現跨日精準復位，所有成像系統均基于一個集成頭架接口的校準標尺進行配準：該標尺永久嵌入頭架內，位于目標成像深度且垂直于光軸。

4. 機械穩定性驗證

系統設計要求成像區域沿光學軸（z軸）總位移≤4?μm。通過計算機仿真與臺架測試（懸掛20–100?g砝碼）確認頭架在0.5?N負載下中心撓度≤3.2?μm。活體測試中，在小鼠主動奔跑期間實時監測顱窗位移，結果顯示最大瞬時位移≤2.2?μm，全程總位移≤3.3?μm，完全滿足雙光子鈣成像對穩定性的嚴苛要求。

在清醒、行為活躍狀態下對同一神經元群體進行功能成像

實驗步驟：

本步驟旨在以最小化腦組織移動的方式植入用于頭部固定的頭板，必須嚴格遵守無菌操作以防感染；建議使用5–6周齡小鼠（雄雌均可），且進行膜片鉗記錄時年齡不超過12周，因年長動物顱骨增厚、腦組織特性改變易導致開顱困難、記錄成功率下降及接入電阻升高。

手術開始前以異氟烷麻醉小鼠，通過呼吸頻率和足趾夾捏反射確認麻醉深度，雙眼涂眼科凝膠防干燥，置于加熱墊保溫并將頭部牢固固定于立體定位儀。隨后剃除頭頂被毛、消毒，并在切口周圍皮下注射局部鎮痛藥（如利多卡因/羅哌卡因）。沿顱骨輪廓切除圓形皮膚，徹底刮除頂骨與間頂骨表面及顱縫處的骨膜軟組織（殘留會導致頭板松動；可用生理鹽水濕潤以助識別），再用組織粘合劑封閉皮膚邊緣。待顱骨干燥后，輕磨骨面（避開目標區），沿顱縫涂3–4層組織粘合劑粘合骨片至無相對移動并覆蓋其余骨面。接著用組織粘合劑初步固定頭板，再以牙科水泥牢固包埋，覆蓋所有暴露顱骨（僅留目標腦區）并在該區域周圍構筑1–2 mm高記錄腔壁（用于放置AgCl接地電極及微電極通道）；

若頭板為金屬須確保腔內金屬完全被水泥覆蓋以實現電絕緣。最后以Kwik-Cast硅膠密封開顱區，皮下注射全身鎮痛藥并在術后48小時內持續鎮痛、提供濕糧。術后進入行為訓練與習慣化階段：每日將小鼠頭部固定于實驗裝置中最多1小時，直至其表現規律運動（如跑輪奔跑）和舒適體態（尾巴下垂、無身體扭曲），期間可同步訓練特定頭部固定行為任務。

寬場成像頭部固定

首先，在實驗前至少7天完成慢性顱骨窗植入手術確保小鼠（通常為5–8周齡C57BL/6J或表達GCaMP等鈣指示劑的轉基因品系）充分恢復；從術后第3–5天起開始行為習慣化訓練，每日用法蘭絨布溫和包裹小鼠進行轉移并逐步引入短時間（5–10分鐘）的頭部固定于行為平臺，隨后逐漸延長至30–60分鐘，直至小鼠表現出安靜呼吸、自發跑輪運動、尾巴自然下垂且無掙扎或過度理毛等應激行為，通常需5–7天完成適應。實驗當日，將實驗室環境控制在安靜、柔和光照和22–24°C室溫條件下，提前開啟寬場成像系統、行為記錄設備（如跑輪旋轉編碼器、眼動追蹤及全身攝像系統）以及視覺刺激顯示器并進行預熱與校準。輕柔地從飼養籠中取出小鼠，用法蘭絨布包裹以減少應激迅速轉移至成像平臺。將小鼠頭部牢固夾持于標準化頭柱夾具中，確保鈦合金頭板與夾具完全貼合、無松動；同時調整身體支撐結構（如泡沫墊或氣浮式移動家籠），使小鼠可在固定狀態下自由奔跑，尾部自然下垂。校準“小鼠-屏幕”幾何關系（距離15–20 cm，雙眼正對中心）確保視角一致。以皮層血管為參照對焦同步記錄跑輪、行為視頻及刺激。

動物頭部固定行為實驗裝置核心在于實現清醒、行為活躍狀態下穩定、長期的神經記錄或成像，同時通過受控的運動方式維持動物自然的感覺-運動交互。與自由活動范式不同，該方法通過固定頭部來提供高分辨率神經技術（如雙光子顯微鏡、電生理記錄或寬場成像）所必需的機械穩定性，同時允許動物通過自由旋轉的跑輪、氣浮球面平臺或線性軌道等方式主動參與行為任務。

關鍵設計原則：

1. 剛性頭部固定：通過手術將定制頭板牢固植入顱骨，再與實驗平臺上的夾具精確對接，確保在數小時乃至數周的實驗中頭部位移控制在微米級，滿足光學或電生理記錄對穩定性的嚴苛要求。

2. 自然運動保留：盡管頭部被固定，大鼠仍可通過四肢驅動低慣性跑輪或在氣浮球上行走，產生真實的本體感覺、觸覺和運動輸出，從而維持接近自然狀態下的神經動力學（如運動調制、空間導航相關活動）。

3. 多模態行為整合：系統通常集成視覺/聽覺刺激呈現、舔水獎勵裝置、觸須刺激器、眼動追蹤及全身視頻監控，支持復雜感知-決策-動作閉環任務（如辨別任務、工作記憶或運動學習）。

4. 長期可重復性：借助標準化頭架接口和跨日空間配準（例如使用校準標尺或血管圖譜），可在同一動物、同一腦區進行連續數周至數月的縱向觀測，適用于發育、學習、疾病進展或干預療效研究。

總結

動物頭部固定行為裝置并非簡單限制動物自由，而是一種平衡了實驗精度與行為生態效度的先進神經科學平臺，為在細胞或環路水平解析清醒大腦如何在主動行為中處理信息提供了強大工具。

文獻引用：

• Durand, S., Heller, G.R., Ramirez, T.K. et al. Acute head-fixed recordings in awake mice with multiple Neuropixels probes. Nat Protoc 18, 424–457 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-022-00768-6

• Stuart, S.A., Palacios-Filardo, J., Domanski, A. et al. Hippocampal-dependent navigation in head-fixed mice using a floating real-world environment. Sci Rep 14, 14315 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-64807-w

• Groblewski PA, Sullivan D, Lecoq J, de Vries SEJ, Caldejon S, L'Heureux Q, Keenan T, Roll K, Slaughterback C, Williford A, Farrell C. A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice. J Neurosci Methods. 2020 Dec 1;346:108922. doi: 10.1016/j.jneumeth.2020.108922. Epub 2020 Sep 15. PMID: 32946912.

• Juczewski, K., Koussa, J.A., Kesner, A.J. et al. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Sci Rep 10, 12245 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-69132-6

• Rebecca Jordan,Optimized protocol for in vivo whole-cell recordings in head-fixed, awake behaving mice,STAR Protocols,Volume 2, Issue 1,2021,100347,ISSN 2666-1667,https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100347.(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S266616672100054X)

• Wienisch, M., Blauvelt, D.G., Sato, T.F., Murthy, V.N. (2011). Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. In: Fellin, T., Halassa, M. (eds) Neuronal Network Analysis. Neuromethods, vol 67. Humana Press. https://doi.org/10.1007/7657_2011_18

• Goldey, G., Roumis, D., Glickfeld, L. et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc 9, 2515–2538 (2014). https://doi.org/10.1038/nprot.2014.165

腦聲小店基于深度科研洞察，專注為動物實驗提供"簡器械·精實驗"解決方案。我們突破高精設備局限，開發手工定制化儀器及配件，通過科研巧思將基礎工具轉化為創新實驗方案。產品涵蓋行為學裝置、操作輔助工具等，使實驗室在保持操作簡效的同時，實現精細化數據采集，助力科研人員以創造性思維發掘簡易儀器的潛在科研價值。