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師兄，我的培養(yǎng)基脫氣少了一會，OCR 和 ECAR 的基線波動就很大

如果沒有充分脫氣，放入儀器后培養(yǎng)基里溶解的 CO? 會迅速逸出，導(dǎo)致 pH 持續(xù)上升，細(xì)胞代謝狀態(tài)會受到影響，數(shù)據(jù)也就不能反映真實(shí)情況了。

崩潰！就湊合了這一步，一整周白干了！

你是不是也遇到過類似翻車現(xiàn)場？細(xì)胞能量代謝檢測，細(xì)節(jié)決定成敗，相關(guān)的知識儲備很重要！1 分鐘參與安捷倫 Seahorse 能量代謝學(xué)術(shù)營挑戰(zhàn)知識小測（有獎(jiǎng)答題），不僅能幫你避開實(shí)驗(yàn)大坑，還有機(jī)會贏取小米藍(lán)牙耳機(jī)、磁吸充電寶、護(hù)眼臺燈、文具套裝、保溫杯、京東卡等 300 份精美好禮！

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（答案都在本文內(nèi)哦，請耐心閱讀）

做細(xì)胞能量代謝檢測都要注意哪些細(xì)節(jié)呢？這就以最常用的【ATP 產(chǎn)生速率檢測】為例，為大家詳解實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和操作方案：

實(shí)驗(yàn)前一天

1. 打開 Seahorse 代謝分析儀，使溫度穩(wěn)定。

2.對于貼壁細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長培養(yǎng)基將細(xì)胞以預(yù)先確定的密度接種到 Seahorse XF 微孔板（懸浮細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天準(zhǔn)備即可）。

3.在 37℃ 無 CO? 培養(yǎng)箱中過夜水化探針板。

4. 在 Wave 里設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)或使用 ATP 產(chǎn)生速率實(shí)驗(yàn)?zāi)０澹?biāo)準(zhǔn)或誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)）。根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對模板進(jìn)行必要的分組修改。

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天

1. 無菌條件下，往 100 mL Seahorse XF DMEM 培養(yǎng)基，pH 7.4 中添加 10 mM XF 葡萄糖，1 mM XF 丙酮酸鈉，2 mM XF 谷氨酰胺。這些是推薦的起始條件；然而，所需的檢測液組分可根據(jù)細(xì)胞類型或體外培養(yǎng)條件而改變。

2. 溫?zé)釞z測液到 37℃。

3. 37℃ 孵育直至準(zhǔn)備使用。

注意：如果檢測液與此配方有顯著不同（即更高濃度的 XF 葡萄糖，XF 丙酮酸鈉或 XF 谷氨酰胺和 / 或其他培養(yǎng)基添加劑），如有必要，檢查檢測液的 pH 值并調(diào)至 7.4，需按照 Buffer Factor Protocol 測定緩沖系數(shù)值。

準(zhǔn)備 Seahorse XF 細(xì)胞培養(yǎng)微孔板：

對于貼壁細(xì)胞：

1. 從 37℃ CO? 培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)微孔板，在顯微鏡下檢查細(xì)胞以確認(rèn)種板的一致性和正常的細(xì)胞形態(tài)。

2．棄去細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中的細(xì)胞生長培養(yǎng)基。使用多通道移液器用預(yù)熱的檢測液洗細(xì)胞一次，然后置于 37℃ 無 CO? 培養(yǎng)箱中用檢測液孵育 45～60 分鐘。

3. 在開始 XF 實(shí)驗(yàn)前，再次棄去檢測液并在每孔加入新鮮，預(yù)熱的檢測液。

對于懸浮細(xì)胞：

1. 從生長培養(yǎng)基中沉淀細(xì)胞，并用預(yù)熱的檢測液重懸。

2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，以這樣一個(gè)濃度懸浮細(xì)胞，即 50 μL（XF96 / XFe96）或 100 μL（XFe24）細(xì)胞包含每孔所需要的細(xì)胞數(shù)，留 4 個(gè)沒有細(xì)胞的孔作為背景校正孔。

3. 加入所需的細(xì)胞 / 孔，然后溫和地離心使細(xì)胞貼壁。

4. 每孔輕輕加入檢測液。實(shí)驗(yàn)前將板子放在 37℃ 無 CO? 的培養(yǎng)箱中孵育 45～60 分鐘。

準(zhǔn)備化合物儲液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：

1. 輕彈試劑管子確保在打開管子前粉末在管子底部。

2. 按照下表，用適當(dāng)體積的檢測液重懸每種組分。旋渦震蕩約 1 min 以確保化合物完全重懸。

準(zhǔn)備加入探針板加藥孔中的化合物：按下表所示，每種化合物各用檢測液配制 3 mL。推薦使用 1.5 μM 的寡霉素和 0.5 μM 的魚藤酮 + 抗霉素 A（終濃度）。

將化合物加入探針板加藥孔中

標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)- 在寡霉素和魚藤酮/抗霉素 A 之前沒有急性注射。將化合物加入已水化的探針板加藥孔中：加藥孔 A：寡霉素 加藥孔 B：魚藤酮/抗霉素 A

誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)- 注射一種測試化合物，加入加藥孔 A 中，按如下所示：加藥孔 A：實(shí)驗(yàn)化合物（急性注射）或溶劑對照 加藥孔 B：寡霉素 加藥孔 C：魚藤酮 / 抗霉素 A

運(yùn)行 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定

安捷倫科技有限公司是生命科學(xué)與研究領(lǐng)域的全球領(lǐng)導(dǎo)者，始終致力于提供前沿的分析解決方案與創(chuàng)新技術(shù)。在細(xì)胞代謝研究領(lǐng)域，安捷倫推出的 Seahorse XF 分析儀被譽(yù)為活細(xì)胞能量代謝實(shí)時(shí)檢測的「金標(biāo)準(zhǔn)」，深受全球科研人員及藥物開發(fā)專家的信賴。

該技術(shù)不僅能夠?qū)崟r(shí)、無標(biāo)記地監(jiān)測細(xì)胞能量代謝狀態(tài)，更在揭示疾病機(jī)制、加速新藥研發(fā)以及推動基礎(chǔ)科學(xué)研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，廣泛應(yīng)用于癌癥研究、免疫代謝、神經(jīng)科學(xué)等多個(gè)前沿領(lǐng)域。

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內(nèi)容策劃：沈佳鈺

內(nèi)容審核：朱曉芳