單分子熒光方法揭示DNA聚合酶Ⅰ選擇性的動力學機制 | 進展

DNA聚合酶是負責DNA復制、修復和重組的關鍵酶，其復制保真度對維持基因組穩定性和預防疾病至關重要。DNA聚合酶通過動力學校對實現高保真度，其復制錯誤率可低10-6，然而，受限于傳統的“開放-閉合”二態模型,該機制尚未成功應用于量化聚合酶的保真度。近年來研究發現，大腸桿菌DNA聚合酶I在核苷酸結合過程中存在一個“半開”構象，可能作為新的保檢查點，但其動力學路徑以及對保真度的定量貢獻，至今仍未明確。

近期，中國科學院物理研究所/北京凝聚態物理國家研究中心軟物質物理實驗室SM4組長期致力于單分子酶動力學與生物界面物理的研究，結合單分子熒光成像技術與脂質體封裝技術，深入探索了DNA聚合酶I通過“開放”與“半開”構象的雙重篩選，實現DNA高保真復制的分子機制，解釋了DNA聚合酶I的復制錯誤率能低至10-6量級的根本原因，取得了以高時間分辨率長時間觀測單個酶分子構象變化的突破。

研究團隊通過將DNA聚合酶及其底物封裝進脂質體，然后置于共聚焦顯微鏡觀測，成功延長了基于擴散的共聚焦顯微鏡的觀測時間，從而實現了以高時間分辨率（0.5 ms）長時間觀測單個聚合酶分子的構象變化。利用這一技術，研究團隊發現，聚合酶會在“開放”和“半開”兩個構象識別并拒絕錯誤核苷酸，“開放”和“半開”構象形成兩道連續的保真檢查點，并且該雙重選擇機制對脫氧核苷酸和核糖核苷酸均具有高效的篩選能力。研究團隊基于這一發現提出了DNA聚合酶對核苷酸進行兩次篩選的模型，并量化了模型中的各項參數。該研究不僅加深了科學界對DNA復制高保真分子基礎的理解，也為未來針對DNA復制相關疾病的藥物設計和高保真酶工具的開發提供了潛在的新靶點與理論模型。

圖：構建的動力學校對的反應模型（左），紅色箭頭表示聚合酶對核苷酸的兩次篩選，以及正確和錯配條件下聚合酶的自由能壘圖（右）。

本研究的共同第一作者包括華南師范大學的博士研究生苑野，中國科學院物理研究所的博士研究生王浩，博士后付航，共同通訊作者為中國科學院物理研究所博士后賈棋（已出站）、李明研究員及陸穎研究員。此項研究受到了國家自然科學基金委、科技部和中國科學院等資助。研究成果已在《Journal of the American Chemical Society》雜志發表，題為“Mismatched Nucleotide Rejections at the Open and Ajar States of 2 DNA Polymerase I Ensure High Fidelity”。

編輯：辣條

轉載內容僅代表作者觀點

不代表中科院物理所立場

如需轉載請聯系原公眾號