沒有增強Fc效應功能的“理想突變”

很多抗體的藥理活性主要由其Fc段決定，包括與補體蛋白C1q結合可啟動補體依賴細胞毒作用（CDC）。與白細胞上的Fcγ受體結合，則介導抗體依賴的細胞毒作用（ADCC）或抗體依賴的細胞吞噬作用（ADCP）。與新生兒Fc受體（FcRn）結合，使IgG獲得較長的血清半衰期。

通過對Fc部位的點突變可以改變抗體與Fc受體的親和力，以增強CDC、ADCC和/或ADCP活性。然而，尚缺乏對這些不同變體的系統比較。有研究以抗CD20抗體rituximab的Fab為固定骨架，構建了21株含不同Fc突變的抗體，并在細胞模型中系統比較了它們的活性。同時，評估了各變體的熱穩定性，發現許多變體相比野生型有所下降。21株抗體對應的Fc突變，列表如下。

Fc效應細胞生物活性檢測

使用Promega的Fc效應細胞生物活性報告基因檢測系統，評估抗CD20抗體與細胞Fcγ受體的結合能力，從而間接反映其介導ADCP或ADCC的潛力。

靶細胞采用CD20陽性人B淋巴細胞系Raji，效應細胞用的是轉染了特定人Fc受體，并攜帶由NFAT啟動子驅動的熒光素酶報告基因Jurkat細胞系。

EC50值與野生型IgG1相比差異在3倍以內，視為“中性”；低于3倍，視為“增強”；高于3倍：視為“降低”。

結果總結于下表，主要發現如下：

野生型IgG3：盡管與重組Fc受體結合力強，但在所有ADCC/ADCP實驗中活性極低。

FcγRI介導的ADCP：無變體表現出增強活性，部分明顯降低。

FcγRIIIa介導的ADCC（兩種等位基因）：22個變體中，14個表現出增強活性，尤其對158F等位基因（通常與IgG1結合較弱）增強更明顯；5個活性降低，3個無顯著變化。

FcγRII相關活性：7個變體無增強；12個僅對某一亞型或等位基因有增強；3個對所有三種形式均有增強。

補體依賴細胞毒作用（CDC）

使用Svari Lite檢測系統評估全部變體的CDC活性。靶細胞采用表達CD20的人B細胞系Ramos，轉染并表達Svar熒光素酶。

結果見上表，顯示野生型IgG3與IgG1活性相當；11個變體與IgG1持平（綠色部分）；6個變體CDC增強（藍色部分）；5個變體CDC減弱或幾乎喪失（紅色部分）。

熱穩定性

采用Protein Stable SUPR-DSF系統的差示掃描熒光法（DSF）測定。

分析指標：Ton（起始熔解溫度）；Tm（第一熔解峰溫度，對應CH2結構域）

野生型IgG1：Ton=63.1℃；Tm=73.2℃

判定標準：Ton<61.9℃（<3×誤差）為顯著降低；Tm<72.6℃為顯著降低

結果顯示，22個變體中，18個Ton與Tm均顯著降低，部分下降超過20℃；僅4個變體的熱穩定性與野生型IgG1相當。

增強FcγR結合策略的根本目的是提高抗體殺傷腫瘤的效力，但究竟應優先增強ADCP（FcγRI或FcγRIIa介導）、ADCC（FcγRIIIa介導）、CDC，還是減弱抑制性受體FcγRIIb的負向調節信號，抑或多種效應聯合優化，目前尚無定論，且“增強到何種程度”也缺乏共識。本研究采用了一組V區與IgG1同種異型完全一致的抗體（均以利妥昔單抗的V區為骨架），采用常規、可重復的細胞學實驗（ADCC、ADCP、CDC）進行平行比較，并用高通量DSF檢測熱穩定性。所用變體涵蓋WHO INN名單（截至2022年4月）、IMGT收錄及文獻報道的其他突變。

FcγRI受體與ADCP相關，研究顯示，幾乎沒有專門增強FcγRI結合或ADCP的突變。測試的變體大多無明顯提升；最強的增強僅為1.87倍（S239D/A330L/I332E），7個變體活性反而下降3倍以上。

提高ADCC的手段最早、最廣泛應用的是降低Fc糖基化的巖藻糖含量，即去巖藻糖化（Afucosylation）。截至2023年底，FDA已批準7款去巖藻糖抗體（amivantamab、belantamab mafodotin、benralizumab、inebilizumab、mogamulizumab、obinutuzumab、ublituximab），通常通過在缺乏巖藻糖基轉移酶的細胞系中表達實現。去巖藻糖變體在FcγRIIIa-158V效應細胞中ADCC提高31倍，在158F細胞中提高201倍；但ADCP（FcγRI或FcγRII各亞型）未見明顯變化。

單點突變F243L與T393A，這兩個單點突變單獨存在時未顯著提升ADCC、ADCP或CDC。它們最初是在核糖體展示篩選出的三突變體F243L/T393A/H433P中被認為對ADCC有貢獻。T393A也出現在Fc融合蛋白conbercept中，但未給出選用理由。

CDC專用突變E430G與K326W/E333S，這兩個變體專門設計用于增強CDC。E430G使CDC提高6倍，但ADCC與FcγRIIa介導的ADCP下降。K326W/E333S則使CDC提高7倍，伴隨ADCC、ADCP下降。

多功能突變G236A/S267E/H268F/S324T/I332E，該五聯突變對所有FcγRII亞型（包括抑制性FcγRIIb）的ADCP均增強，CDC也增強，但ADCC無顯著變化。值得注意的是，它對FcγRIIb的提升高于FcγRIIa，這解釋了為何以前用共表達兩種受體的巨噬細胞檢測時未觀察到ADCP凈增加。

S267E、S267E/L328F、N325S/L328F三種突變體對FcγRIIIa-介導的ADCC完全失活；對FcγRIIa-131H的ADCP基本不變，但可顯著提升對FcγRIIa-131R和抑制性受體FcγRIIb的ADCP。CDC活性則各不相同：S267E提高3倍，S267E/L328F基本不變，N325S/L328F完全喪失。

14種突變體顯著提升ADCC，且對低親和力等位基因FcγRIIIa-158F的提升（17-333倍）遠高于對高親和力158V的提升（12-62倍）。

在ADCP與CDC方面，各突變體表現各異。L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L，對FcγRIIa-131R無增強，但對131H與FcγRIIb有增強；CDC不變。S298A/E333A/K334A，ADCP不變，CDC增強；G236A/A330L/I332E與G236A/S239D/A330L/I332E，對兩種FcγRIIa亞型均增強ADCP，但對FcγRIIb無變化且CDC完全喪失；G236A/H268F/S324T/I332E，ADCP類似，CDC輕度增強；S239D/K274Q/Y296F/Y300F/L309V/I332E/A339T/V397M與G236A/S239D/I332E，對所有FcγRII亞型均顯著增強ADCP，CDC變化不大。值得注意的是，tafasitamab與talacotuzumab文獻常僅提S239D/I332E，其實際序列為8突變體，活性遠高于S239D/I332E雙突變。S239D/A330L/I332E與S239D/I332E相比，對FcγRIIa-131R的ADCP降至野生型水平且CDC消失。P247I/A339Q、F243L/R292P/Y300L/V305L/P396I、D270E/K326D/A330M/K334E及異二聚體Fc(L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A//D270E/K326D/A330M/K334E）四種突變體均提升對FcγRIIa-131H的ADCP，對131R與FcγRIIb無變化；CDC則分別為下降8倍、上升6倍、基本不變、基本不變。

腫瘤治療通常期望高ADCC且FcγRIIa:FcγRIIb激活/抑制比高。按此標準，G236A/S239D/A330L/I332E表現最優，但A330L使其CDC完全喪失；去掉A330L（G236A/S239D/I332E）可恢復CDC，卻顯著提高了對抑制性FcγRIIb的結合。若CDC必須保留，F243L/R292P/Y300L/V305L/P396I是較好折中方案。迄今為止，尚未出現同時理想提升ADCC、ADCP、CDC且無FcγRIIb副作用的“完美”突變。

還需要注意的是，各突變體的熱穩定性普遍下降。22個變體中18個熱穩定性顯著降低，CH2結構域Tm最多下降21℃。活性最高的G236A/S239D/A330L/I332E與G236A/S239D/I332E恰是下降最嚴重者（≈20℃）。異二聚體Fc雖經過設計以提高穩定性，Tm仍下降約16°C。熱穩定性降低可能影響生產、儲運、聚集及免疫原性，需逐一評估。

與大量“沉默型”突變抗體已上市相比，真正進入臨床的增強型突變極少。原因可能包括：可選方案過多，決策困難；熱穩定性風險阻礙商業化。