Nature?|?配體特異性激活軌跡決定GPCR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

撰文|存中一貫

細(xì)胞表面受體被胞外配體激活是細(xì)胞間通訊的標(biāo)志性事件，調(diào)控著人體絕大多數(shù)生理功能。G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是最大的膜受體家族，配體激活后，GPCR通過招募并激活細(xì)胞內(nèi)的G蛋白將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)部【1】。配體能以不同強(qiáng)度激活（激動(dòng)劑）或抑制（拮抗劑）受體，這種配體激活效能的多樣性是藥物開發(fā)的基礎(chǔ)【2】。然而，配體效能的內(nèi)在分子本質(zhì)及其在活細(xì)胞中激活GPCR的具體機(jī)制，目前還不清楚。

近年來，一些熒光光譜實(shí)驗(yàn)以及核磁共振（NMR）研究證實(shí)，GPCR并非作為簡單的開關(guān)運(yùn)作，而是在多種失活態(tài)與激活態(tài)之間保持動(dòng)態(tài)平衡【3,4】。部分激動(dòng)劑（Partial agonists）和完全激動(dòng)劑（full agonists）所維持的GPCR-G蛋白復(fù)合物構(gòu)象完全不同。有觀點(diǎn)認(rèn)為，部分激動(dòng)劑穩(wěn)定的GPCR-G蛋白復(fù)合物，其介導(dǎo)核苷酸交換的效能有所降低【5,6】。不過，所有這些研究都是在分離體系中進(jìn)行的，使用了在去垢劑膠束或納米盤中重構(gòu)的純化受體。GPCR在活細(xì)胞的生理環(huán)境中是否也會(huì)采取不同構(gòu)象并形成不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，目前還不清楚。

近日，來自德國萊比錫大學(xué)的Andreas Bock團(tuán)隊(duì)聯(lián)合Irene Coin團(tuán)隊(duì)在Nature雜志發(fā)表了他們最新的研究成果，題目是

Ligand-specific activation trajectories dictate GPCR signalling in cells

GPCR的激活會(huì)導(dǎo)致受體發(fā)生大規(guī)模的構(gòu)象變化，最顯著的是TM6胞內(nèi)部分的向外移動(dòng)，使得其能夠與G蛋白偶聯(lián)并激活后者。同時(shí)，G蛋白的結(jié)合也會(huì)促進(jìn)受體的構(gòu)象變化，包括其胞外結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合口袋的變化，從而穩(wěn)定激動(dòng)劑的結(jié)合。受體胞外與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間的這種信息傳遞，體現(xiàn)了變構(gòu)耦合的基本原理。

為了高分辨率地監(jiān)測GPCR胞外表面的構(gòu)象變化，研究人員計(jì)劃開發(fā)一種新型的生物傳感器，這種傳感器應(yīng)具備以下特點(diǎn)：具備遺傳編碼特性；配備尺寸最小化的標(biāo)記；保持細(xì)胞內(nèi)表面未修飾，以確保G蛋白偶聯(lián)功能不受影響。滿足上述條件的最佳方法是，利用基因編碼化學(xué)錨定物，然后通過生物正交化學(xué)（bioorthogonal chemistry）方法將探針連接至活細(xì)胞中的GPCR受體上。簡言之，通過遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)（genetic code expansion technology, GCE）將攜帶錨定物的非經(jīng)典氨基酸（non-canonical amino acid, ncAA, 非天然氨基酸）插入到受體的序列中。之后應(yīng)用ultrarapid strain-promoted inverse electron-demand Diels-Alder cycloaddition方法對(duì)添加的非天然氨基酸進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)修飾，以達(dá)到在相應(yīng)氨基酸上進(jìn)行標(biāo)記的目的，這種方法不會(huì)對(duì)既有的功能結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生影響，且反應(yīng)可在幾分鐘內(nèi)完成。利用這種方法，研究人員在M2R受體的胞外區(qū)域進(jìn)行了一系列的標(biāo)記。經(jīng)過一系列熒光檢測，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)位點(diǎn)（Thr84，Glu175，Ala414，Pro415，Phe181，Phe188，Asn419）的插入標(biāo)記能夠?qū)2R全激動(dòng)劑acetylcholine（ACh）敏感。Ach處理能夠明顯檢測到Cy3標(biāo)記熒光的改變，反映了配體刺激引起的M2R胞外構(gòu)象的改變。另外，變構(gòu)激動(dòng)劑LY2119620同樣能夠引起這7個(gè)位點(diǎn)變體的熒光改變，但M2R拮抗劑則完全不能引起熒光的改變。上述檢測結(jié)果表明，這7個(gè)插入突變能夠通過熒光改變來反映配體刺激引起的M2R受體胞外構(gòu)象改變。

上述工具提供了一種不影響受體與胞內(nèi)G蛋白結(jié)合，而檢測配體激活引起的胞外構(gòu)象改變的方法。利用上述工具，研究人員探究了不同配體對(duì)M2R的激活情況，使用的配體包括：全激動(dòng)劑ACh，超級(jí)激動(dòng)劑iperoxo，部分激動(dòng)劑arecoline和pilocarpine。所有這些激動(dòng)劑都能夠引起前述7個(gè)生物感受器的熒光變化，且具有濃度依賴性。整體而言，配體的激活能力越強(qiáng)，其引起的生物感受器熒光改變程度也越大。比如，與全激動(dòng)劑ACh相比，iperoxo在5個(gè)生物感受器中引起的熒光改變程度更大（M2R84，M2R175，M2R414，M2R415，M2R419），僅在M2R188中引起的熒光改變程度較小，而對(duì)M2R181則不敏感，不引起熒光改變。部分激動(dòng)劑Arecoline在所有7個(gè)生物感受器中引起的熒光反應(yīng)程度都比ACh小，而pilocarpine則在M2R181和M2R188中引起的熒光反應(yīng)程度比ACh更顯著，在其他位點(diǎn)都弱于ACh引起的熒光變化。

上述結(jié)果表明，激動(dòng)劑激活引發(fā)的構(gòu)象變化程度，在某些受體位點(diǎn)上與激動(dòng)劑效能呈正比，而在其他位點(diǎn)呈反比，這一觀察結(jié)果表明M2R在活細(xì)胞中呈現(xiàn)多種活性狀態(tài)，這些狀態(tài)對(duì)G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的激活能力各不相同。為探究這種差異性M2R-G蛋白復(fù)合物的存在，研究人員通過增加G蛋白偶聯(lián)來調(diào)控不同狀態(tài)間的平衡。研究人員構(gòu)建了一個(gè)G蛋白突變體GαoA(G203T)，將受體平衡推向高效價(jià)、高親和力的M2R-G蛋白復(fù)合物狀態(tài)。該Gα突變體對(duì)GDP和GTP均具有低親和特性，其與激動(dòng)劑結(jié)合受體的偶聯(lián)可形成穩(wěn)定的無核苷酸受體-GαoA蛋白復(fù)合物。

后續(xù)熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有M2R生物傳感器均對(duì)GαoA(G203T)過表達(dá)敏感，但響應(yīng)程度強(qiáng)烈依賴于配體和測試的生物傳感器。根據(jù)變構(gòu)偶聯(lián)原理，GαoA(G203T)偶聯(lián)誘導(dǎo)的M2R構(gòu)象變化應(yīng)與胞外激動(dòng)劑結(jié)合引發(fā)的構(gòu)象變化相互映射。在G蛋白過表達(dá)條件下，這些構(gòu)象變化發(fā)生在激動(dòng)劑添加之前。因此，當(dāng)激動(dòng)劑刺激指示高效價(jià)M2R-G蛋白復(fù)合物形成的生物傳感器時(shí)，會(huì)導(dǎo)致熒光發(fā)射強(qiáng)度減弱或無變化。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，GαoA(G203T)過表達(dá)導(dǎo)致M2R175生物傳感器上激動(dòng)劑誘導(dǎo)的熒光變化完全消失，M2R415的熒光變化減少了約30-80%，說明這兩個(gè)位點(diǎn)參與了高效能受體-G蛋白復(fù)合物的形成。而在過表達(dá)GαoA(G203T)的情況下，激動(dòng)劑促進(jìn)的M2R181和M2R188熒光變化增加，可能揭示了與M2R175和M2R415生物傳感器響應(yīng)喪失或減少所揭示的復(fù)合物不同的另一種低效能、可能結(jié)合GDP的M2R-G蛋白信號(hào)復(fù)合物。

進(jìn)一步分析熒光變化動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示高效能復(fù)合物形成較快，而低效能復(fù)合物形成較慢，不同配體在激活受體的過程中會(huì)沿著不同的軌跡形成兩種復(fù)合物。ACh，iperoxo和pilocarpine激活過程中會(huì)首先形成高效能復(fù)合物（C1），其標(biāo)志是175位點(diǎn)感受器熒光的增強(qiáng)，這個(gè)過程發(fā)生在200ms至1s之間。之后，低效能的C2復(fù)合物再緩慢形成，這個(gè)發(fā)生在2-5s之間。最終C1和C2復(fù)合物會(huì)同時(shí)存在，并保持比例平衡。不過，不同配體激活情況下，C1和C2形成的時(shí)間以及比例均有差異。而arecoline介導(dǎo)的激活與上述3個(gè)配體完全不同，它會(huì)首先形成一個(gè)高效能復(fù)合物（C3），但發(fā)生變化的生物感受器位點(diǎn)與之前的不同，說明其形成軌跡具有獨(dú)特性。

上述結(jié)果表明，所有配體介導(dǎo)的M2R激活都會(huì)先后形成高效能以及低效能復(fù)合物，兩種復(fù)合物同時(shí)存在，且保持平衡。每個(gè)配體的激活都具有其獨(dú)特的激活軌跡。本研究通過這些數(shù)據(jù)的分析，展示了GPCR激活過程中配體依賴的受體復(fù)合物形成機(jī)制，為靶向GPCR進(jìn)行的藥物開發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09963-3

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F. & Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature 459, 356–363 (2009).

2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B. & Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 829–842 (2017).

3. Nygaard, R. et al. The dynamic process of β2-adrenergic receptor activation. Cell 152, 532–542 (2013).

4. Manglik, A. et al. Structural insights into the dynamic process of β2-adrenergic receptor signaling. Cell 161, 1101–1111 (2015).

5. Gregorio, G. G. et al. Single-molecule analysis of ligand efficacy in β2AR-G-protein activation. Nature 547, 68–73 (2017).

6. Huang, S. K. et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A2A receptor during G protein coupling. Cell. 184, 1884–1894 (2021).

學(xué)術(shù)合作組織

（*排名不分先后）

戰(zhàn)略合作伙伴

（*排名不分先后）

轉(zhuǎn)載須知

【原創(chuàng)文章】BioArt原創(chuàng)文章，歡迎個(gè)人轉(zhuǎn)發(fā)分享，未經(jīng)允許禁止轉(zhuǎn)載，所刊登的所有作品的著作權(quán)均為BioArt所擁有。BioArt保留所有法定權(quán)利，違者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

近期直播推薦

點(diǎn)擊主頁推薦活動(dòng)

關(guān)注更多最新活動(dòng)！