華南理工大學AM：有機硒水凝膠為糖尿病傷口愈合帶來新希望

糖尿病傷口愈合一直是臨床醫(yī)學面臨的重大挑戰(zhàn)。這類傷口之所以難以愈合，根源在于其特殊的病理微環(huán)境形成了惡性循環(huán)：氧化應(yīng)激持續(xù)存在、晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）不斷積累、慢性炎癥反復發(fā)作，三者相互促進，使傷口無法進入正常的修復階段。盡管現(xiàn)有的抗氧化水凝膠在一定程度上能夠清除活性氧，但它們往往無法同時干預(yù)AGE-RAGE信號通路，且由于交聯(lián)速度過快，難以完美貼合不規(guī)則創(chuàng)面，導致治療效果大打折扣。

近日，華南理工大學邊黎明教授、趙鵬超教授、徐夏憶教授和斯坦福大學Cui Miao合作，報告了一種組織適形的有機硒水凝膠（TCOH），通過微相分離調(diào)控酰腙交聯(lián)動力學，實現(xiàn)了對糖尿病傷口微環(huán)境的多靶點調(diào)控。該水凝膠系統(tǒng)由可微相分離的有機硒聚合物（OSP）和透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼（HA-ADH）組成，能夠在注射后緩慢凝膠化，完美貼合不規(guī)則創(chuàng)面，并通過高密度有機硒基團同時清除活性氧、分解AGEs，從而重建氧化還原穩(wěn)態(tài)，促進血管新生，調(diào)控巨噬細胞極化。相關(guān)論文以“Tissue-Conforming Organoselenium Hydrogel with Microphase-Controlled Acylhydrazone Crosslinking Kinetics Expedites Diabetic Wound Healing by Inhibiting AGE-RAGE Pathways”為題，發(fā)表在

Advanced Materials

研究團隊首先通過RAFT聚合合成了含苯甲醛的共聚物PFA，進而偶聯(lián)有機硒前體得到OSP。核磁共振、凝膠滲透色譜和X射線光電子能譜等多種表征手段證實了有機硒基團的成功引入，硒元素含量達到3.9 wt%。OSP在水溶液中通過疏水相互作用形成明顯的微相分離結(jié)構(gòu)，這種微相分離將苯甲醛基團包裹在疏水微區(qū)內(nèi)，從而延緩了與HA-ADH的酰腙交聯(lián)反應(yīng)。流變學測試顯示，TCOH的凝膠化時間延長至20分44秒，而對照組水凝膠（ConH）僅需1分14秒即完成凝膠化。這一延長的凝膠化窗口使得TCOH前體溶液能夠注入并完美貼合五邊形模具等復雜幾何表面，展現(xiàn)出優(yōu)異的組織適形性和粘附性能。

圖1 | 組織適應(yīng)型有機硒水凝膠（TCOH）用于糖尿病傷口愈合的示意圖。A) OSP的微相分離控制TCOH的酰腙交聯(lián)動力學。B) 具有優(yōu)異組織適應(yīng)性和氧化還原穩(wěn)態(tài)能力的TCOH通過雙重重塑氧化還原和AGE-RAGE穩(wěn)態(tài)加速糖尿病傷口愈合。

完全交聯(lián)后，TCOH的儲能模量達到約4.0 kPa，在頻率掃描測試中儲能模量始終高于損耗模量，在應(yīng)變掃描中線性粘彈區(qū)可達46%應(yīng)變。循環(huán)應(yīng)變測試表明，TCOH在300%高應(yīng)變破壞后能夠在1%低應(yīng)變下快速恢復，展現(xiàn)出優(yōu)異的自愈合性能。掃描電鏡和能譜分析證實，TCOH具有微孔結(jié)構(gòu)，硒元素均勻分布于整個水凝膠基質(zhì)中?？寡趸阅茉u估顯示，在100 μM H2O2模擬病理條件下，TCOH在24小時內(nèi)顯著清除氧化應(yīng)激，并通過谷胱甘肽消耗實驗證實了其再生性抗氧化能力。

圖2 | 疏水性有機硒介導的OSP微相分離賦予TCOH卓越的傷口適應(yīng)性和再生性ROS清除能力。(A) OSP疏水性有機硒介導的微相分離示意圖和顯微鏡觀察。比例尺 = 20 μm。(B) TCOH延遲原位凝膠過程的可視化觀察。(C) TCOH對不規(guī)則圖案的增強適應(yīng)性。比例尺 = 5 mm。(D) 兩種水凝膠的流變時間掃描證實，與ConH的快速凝膠化相比，TCOH的凝膠化動力學延長。(E) 2小時完全交聯(lián)后，TCOH和ConH具有相當?shù)膬δ苣Ａ?(n = 3)。(F) TCOH對豬皮表現(xiàn)出顯著的適應(yīng)性和 (G) 組織粘附性，而ConH則相形見絀 (n = 3)。比例尺 = 10 mm。(H) TCOH和ConH的流變頻率和 (I) 應(yīng)變掃描。(J) TCOH的流變步應(yīng)變振蕩時間掃描表明其良好的自修復性能。(K) SEM和EDS表征驗證了TCOH的微孔結(jié)構(gòu)和硒組分的均勻分布。比例尺 = 10 μm。(L) TCOH表現(xiàn)出再生性氧化還原能力，循環(huán)ROS和GSH清除實驗證明了這一點 (n = 3)。統(tǒng)計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

在細胞層面，CCK-8實驗證實TCOH對NIH/3T3成纖維細胞無細胞毒性。在LPS刺激的巨噬細胞模型中，TCOH處理顯著降低細胞內(nèi)ROS水平，同時下調(diào)M1型標志物CD86表達，上調(diào)M2型標志物CD206表達。RT-qPCR分析進一步證實，TCOH下調(diào)促炎基因（iNOS、IL-6、TNF-α）表達，上調(diào)抗炎基因（Arg-1、IL-10、TGF-β）表達，有效誘導巨噬細胞從促炎M1表型向修復性M2表型轉(zhuǎn)化。

圖3 | 具有卓越細胞內(nèi)ROS清除能力的TCOH誘導巨噬細胞從M1向M2復極化。(A) TCOH處理顯著降低了LPS刺激的細胞內(nèi)ROS表達（DCFH-DA作為熒光ROS探針）至未處理PBS對照水平，而ConH通過免疫熒光染色顯示出有限的ROS清除能力（綠色為ROS探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(B) ROS探針的相對熒光強度 (n = 20)。(C) TCOH處理誘導巨噬細胞從M1向M2復極化的示意圖。(D) 免疫熒光染色結(jié)果表明，與LPS和ConH處理的對照組相比，TCOH處理顯著下調(diào)了巨噬細胞上CD86（M1標志物，綠色）的表達，同時上調(diào)了CD206（M2標志物，綠色）的表達。比例尺 = 50 μm。(E) CD86和CD206生物標志物的相對熒光強度 (n = 20)。(F) M1巨噬細胞標志物（CD86和IL-1β）的基因表達 (n = 4) 以及 (G) M2巨噬細胞標志物（CD206和IL-10）的基因表達，通過RT-qPCR分析評估 (n = 4)。兩種水凝膠組中所有生物標志物的免疫熒光強度統(tǒng)計分析 (n = 20)。統(tǒng)計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

在H2O2誘導氧化應(yīng)激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞模型中，TCOH處理有效清除細胞內(nèi)ROS，恢復細胞增殖能力。劃痕實驗顯示TCOH顯著恢復H2O2損傷的內(nèi)皮細胞遷移能力。更為重要的是，在Matrigel管形成實驗中，TCOH處理使分支數(shù)量增加2.8倍，總分支長度增加5.1倍，而ConH組僅分別增加1.4倍和1.5倍，證實TCOH能夠有效促進血管新生。

圖4 | 具有卓越細胞內(nèi)ROS清除能力的TCOH促進細胞增殖、遷移和血管生成。(A) TCOH保護HUVECs免受ROS損傷、細胞增殖、遷移和血管生成的示意圖。(B) 與未處理PBS對照相比，TCOH顯著中和了H2O2誘導的高ROS表達（DCFH-DA作為熒光ROS探針），而ConH通過免疫熒光染色表現(xiàn)出有限的ROS清除能力（綠色為ROS探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(C) ROS探針的相對熒光強度 (n = 20)。(D) EDU染色結(jié)果表明，TCOH處理通過改善ROS損傷促進了HUVECs的增殖（紅色為EDU探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(E) EDU探針的相對熒光強度 (n = 20)。(F) 在0、12和24小時，經(jīng)歷不同處理的HUVECs的劃痕傷口愈合實驗。比例尺 = 400 μm。(G) 劃痕實驗的定量分析表明與對照組相比，TCOH 處理顯著加快了傷口閉合率（n = 3）。（H）不同處理后 HUVEC 的管形成能力。（I）分支數(shù)量（n = 3）和（J）分支總長度的定量分析表明，TCOH 處理顯著促進了嚴重氧化應(yīng)激下 HUVEC 的管形成（n = 3）。比例尺 = 50 μm。兩個水凝膠組中所有生物標志物的免疫熒光強度統(tǒng)計分析（n = 20）。統(tǒng)計顯著性：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，以及 ****p < 0.0001。

在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠全層皮膚缺損模型中，TCOH單次應(yīng)用顯著加速傷口閉合，至第14天剩余傷口面積僅0.96% ± 0.40%，顯著優(yōu)于ConH和空白對照組。H&E染色顯示TCOH組傷口炎癥浸潤明顯減少，肉芽組織空間顯著縮小，接近正常皮膚結(jié)構(gòu)。Masson三色染色顯示TCOH組膠原沉積高度有序，形成類似真皮的籃織結(jié)構(gòu)。重要器官的H&E染色未觀察到明顯病理損傷，證實了TCOH的良好生物相容性。

圖5 | TCOH加速糖尿病小鼠傷口愈合。(A) 圖示工作流程，說明糖尿病小鼠傷口模型的建立以及通過單次應(yīng)用原位形成TCOH處理糖尿病傷口的實驗時間線。(B) 第0、3、9和14天小鼠模型的代表性照片和 (C) 傷口痕跡表明TCOH處理顯著加速了傷口閉合。比例尺 = 4 mm。(D) 第0、3、9和14天小鼠模型傷口面積百分比的定量分析 (n = 6)。(E) 第14天小鼠模型傷口組織H&E染色的代表性圖像，黃色箭頭突出放大圖像中的炎癥區(qū)域。比例尺 = 400 μm（左）和 50 μm（右）。(F) TCOH、ConH和空白組處理傷口炎癥區(qū)域的定量分析 (n = 6)。(G) TCOH、ConH和空白組處理愈合傷口肉芽組織間隙的定量分析 (n = 6)。(H) 第14天小鼠模型傷口組織Masson三色染色的代表性圖像。比例尺 = 400 μm（左）和 50 μm（右）。(I) TCOH、ConH和空白組處理傷口組織膠原容積分數(shù)的定量分析 (n = 6)。統(tǒng)計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

免疫熒光染色顯示，TCOH處理使傷口組織內(nèi)ROS水平降低97%，CD206/CD86比值顯著升高，證實了其體內(nèi)ROS清除能力和巨噬細胞表型重塑功能。CD31免疫組化染色顯示，TCOH組在第9天和第14天均呈現(xiàn)顯著更高的血管密度，表明其促進血管成熟的能力。

圖6 | TCOH通過病理性ROS中和、M2巨噬細胞極化和增強血管生成加速糖尿病小鼠傷口愈合。(A) 愈合皮膚組織的免疫熒光染色表明，與ConH和PBS處理組相比，TCOH處理顯著減少了傷口誘導的高ROS表達（DHE作為熒光ROS探針）（紅色為ROS探針，藍色為細胞核）。比例尺 = 200 μm。(B) 第14天，經(jīng)PBS（空白）、ConH和TCOH處理的糖尿病小鼠傷口模型愈合皮膚組織中二氫乙錠（DHE）染色區(qū)域的定量分析 (n = 6)。(C) 愈合皮膚組織的免疫熒光染色表明，與PBS和ConH處理的對照組相比，TCOH處理顯著下調(diào)了CD86（M1標志物，紅色）的表達，同時上調(diào)了CD206（M2標志物，綠色）的表達（藍色為細胞核）。比例尺 = 50 μm。(D) 第14天，經(jīng)PBS（空白）、ConH和TCOH處理的糖尿病小鼠傷口模型愈合皮膚組織中CD206（綠色）和CD86（紅色）染色區(qū)域的定量分析 (n = 6)。(E) 愈合皮膚組織的IHC染色表明，與第9天和第14天的ConH和PBS處理組相比，TCOH處理顯著促進了血管生成。比例尺 = 100 μm。(F) 第9天和第14天，經(jīng)PBS（空白）、ConH和TCOH處理的糖尿病小鼠傷口模型愈合皮膚組織中CD31陽性區(qū)域的定量分析 (n = 6)。統(tǒng)計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

轉(zhuǎn)錄組學分析揭示，TCOH處理上調(diào)1024個基因，下調(diào)724個基因。GO富集分析顯示谷胱甘肽過氧化物酶相關(guān)基因顯著富集，ELISA檢測證實傷口組織內(nèi)源性GSH水平升高。KEGG和GSEA分析顯示AGE-RAGE和NF-κB信號通路顯著抑制，IL-17信號通路下調(diào)，p53通路激活。Western Blot驗證了TCOH處理顯著降低RAGE蛋白表達，抑制NF-κB磷酸化，同時上調(diào)GPX1表達，從蛋白水平證實了多靶點調(diào)控機制。

圖7 | TCOH、ConH和空白處理的糖尿病傷口組織的轉(zhuǎn)錄組學分析 (n = 3)。(A) 圖示說明TCOH處理下糖尿病傷口愈合的潛在分子信號通路。TCOH和空白處理組之間差異表達基因的（B）抗氧化調(diào)節(jié)和（C）巨噬細胞極化調(diào)節(jié)的基因本體論（GO）富集分析。(D) TCOH和空白處理組之間差異表達基因的KEGG富集分析。TCOH和空白處理組之間的（E）AGE-RAGE和（F）NF-κB信號通路的GSEA分析。TCOH和ConH處理組之間差異表達基因的（G）傷口修復增強和（H）糖脂代謝校正的GO富集分析。(I) TCOH和ConH處理組之間差異表達基因的KEGG富集分析。(J) TCOH、ConH和空白處理傷口組織中表達的RAGE、p-NF-κB、NF-κB和GPX1蛋白的代表性WB圖像。(K) WB結(jié)果的定量分析 (n = 3)。統(tǒng)計學意義：ns，不顯著；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。

總而言之，這項研究通過將動態(tài)材料適應(yīng)性與多靶點病理調(diào)控相結(jié)合，成功開發(fā)出一種組織適形有機硒水凝膠，能夠通過催化清除ROS和分解AGE-RAGE結(jié)合雙重重塑病理微環(huán)境，驅(qū)動M1向M2巨噬細胞極化轉(zhuǎn)變，同時促進血管新生，加速功能性傷口愈合。這一創(chuàng)新平臺不僅為糖尿病傷口治療提供了新策略，也為其他具有相似氧化還原失衡和慢性炎癥病理特征的慢性疾病治療開辟了新途徑。