T細胞銜接器（TCE）3個月毒理研究的意義—Amgen分享的4個內部真實案例

T細胞銜接器（TCE）主要通過結合CD3，將患者的細胞毒性T細胞與表達特定抗原（如腫瘤細胞上的腫瘤相關抗原TAA）的靶細胞連接起來。隨后形成的溶細胞性突觸會誘導依賴靶細胞的多克隆T細胞活化與增殖，最終導致腫瘤靶細胞凋亡。最早獲批的TCE為catumaxomab（2009年）和blinatumomab（2014年）；2021-2023年又有7款TCE獲批。這些均遵循ICH S6和S9建議，在開展注冊性臨床試驗前，需進行較長期的重復給藥毒理學研究。

雙特異性T細胞銜接器（BiTE?）分子是TCE的一種，由美國安進公司開發，其將兩種不同單克隆抗體的可變區整合到一條多肽鏈中。在體內同時結合CD3與其特定靶蛋白時，通常在首次給藥后48小時內會出現“標志性”效應，包括體溫短暫升高、急性期反應（可能伴隨細胞因子和C反應蛋白短暫升高）、血液學變化（如淋巴細胞短暫減少）以及T細胞活化跡象等。安進的BiTE?開發策略包括：1）臨床前階段會對人及相關非臨床種屬中靶TAA進行早期全面的正常組織表達譜分析，綜合mRNA、蛋白等相關數據，評估動物在未來非臨床安全性研究中的潛在相關性；2）安進的專有CD3結合劑僅與人類和非人靈長類動物（NHP）交叉反應，因此若能與NHP的TAA交叉反應，NHP便是臨床BiTE?候選藥物測試的唯一具有藥理學相關性的毒理研究種屬。理想情況下，當NHP與人類的靶標分布相似時，可在NHP中評估分子安全性，以識別潛在的靶器官毒性；若存在表達差異，需考慮NHP對各靶器官安全性的評估能力，對不表達靶標的NHP器官/系統，可能需通過體外等替代方法評估人類安全風險；3）體外系統用于驗證新型BiTE?分子在人類和NHP中對效應細胞的銜接作用相似；驗證正常組織中靶標表達相當以及T細胞介導的體外活性，以確認NHP是特定BiTE?候選分子的相關動物種屬。若無法與NHP的TAA交叉反應，可能開發在NHP或嚙齒類動物中具有等效藥理活性的替代TCE分子。

多數情況下，探索性2周重復給藥研究可生成初步毒代動力學數據并早期識別毒性，為后續1個月GLP重復給藥研究（簡稱“1個月研究”）的劑量選擇提供依據，該1個月研究（在NHP中進行，若使用嚙齒類替代物則在嚙齒類中進行）可支持IND申請。根據ICH S9，在關鍵的注冊性人體臨床試驗開始前，可在同一種屬中補充3個月GLP重復給藥毒理學研究（簡稱“3個月研究”）。依據ICH S9和3R原則（替代、減少、優化），僅當預期出現毒性且無法僅通過受影響靶器官及其生物學特性預測毒性可逆性時，才在研究中設置恢復組。

治療性蛋白常被免疫系統視為異物，潛在引發抗藥物抗體（ADA）反應。人類中治療性蛋白的免疫原性受蛋白結構、制劑、給藥途徑、劑量水平、給藥頻率/持續時間及患者特異性因素等影響，且ADA發生率常呈劑量依賴性增加。噬菌體展示技術的進步和轉基因小鼠的應用助力全人源抗體的研發，降低了患者產生ADA的風險。動物用于非臨床藥效學和安全性研究時，所給藥的分子可能被視為異物（人類來源）并誘導ADA。已知用于人類的生物治療藥物在NHP的安全性評估中可能引發ADA，但NHP中的ADA無法預測人類的免疫原性。ADA會從多方面干擾動物毒理學研究的解讀：一是結合藥物并改變其動力學（如降低暴露量）；二是阻止靶標結合，阻斷分子的藥理或毒理作用；三是與藥物在循環中形成免疫復合物（ICs），可能通過沉積在腎臟（腎小球）、血管、滑膜、肺、肝、皮膚、眼、脈絡叢等組織，引發ICs介導的不良事件，導致炎癥及后續組織損傷。ICs的形成可能起初較緩慢，但可能進展為包括血小板活化、廣泛組織炎癥（如血管炎、腎小球腎炎）、臨床癥狀甚至死亡等一系列反應，這會嚴重影響包括NHP在內的動物種屬長期研究的價值。

因此，經驗表明，對于BiTE?的開發，1個月研究常能生成有意義的IND支持性安全信息；早期開展3個月研究以支持IND申報，可能因ADA的影響而無法獲得有意義的安全信息。

安進公司探討了BiTE?分子在NHP中的3個月研究相較于短期研究，是否能識別更多非臨床安全信號。本研究探討的關鍵問題包括：1）在3個月研究期間，NHP中BiTE?分子的暴露是否維持穩定？2）3個月內重復給藥BiTE?分子，是否能在1個月研究建立的非臨床安全譜基礎上提供更多有意義的信息（即對分子的臨床應用或開發路徑產生影響）？3）可通過哪些論據說服監管機構3個月研究并非必需？

看下安進公司分享的4個內部案例。

案例A：與監管機構達成開展3個月研究的共識

分子A的基本情況及1個月研究結果

分子A靶向血液瘤。在1個月研究中，按0、5、25、125μg/kg的劑量每周對動物進行靜脈注射，每組6只（雌雄各半），動物可以耐受。中劑量組和高劑量組觀察到了BiTE?分子活性的標志性特征。

與分子A相關的微觀觀察結果出現在淋巴結（中、高劑量組）和脾臟（僅高劑量組），表現為生發中心輕微增加，具體特征為濾泡生發中心增大、易染體巨噬細胞數量增多。高劑量組生發中心增大與2只雄性動物的腸系膜淋巴結肉眼可見增大以及脾臟重量增加相關。這一變化被解讀為可能是對藥物相關循環淋巴細胞減少的再生反應，且不被視為不良反應。

低劑量組和中劑量組未出現ADA，但高劑量組100%的動物產生了IgG型ADA，其中67%的動物因ADA導致藥物暴露量顯著降低（AUC降低15%及以上）。

3個月研究的設計及結果

開展分子A的3個月研究的理由未與任何機構討論，因為似乎沒有充分依據支持這一請求。由于低劑量組和中劑量組動物未產生ADA，且觀察到了BiTE?分子活性的標志性特征，因此有潛力在這些劑量水平下評估該分子長期給藥的效果。

考慮到ADA發生率常呈劑量依賴性增加，將1個月研究中的中劑量（25μg/kg）作為3個月研究的低劑量，同時采用未測試過的75μg/kg作為高劑量，旨在降低分子的免疫原性。

3個月研究中，僅低劑量組的2只動物在整個研究期間維持了藥物暴露；其余所有動物均因ADA形成而導致暴露量下降。因此，盡管治療周期為3個月，但大多數動物在給藥1個月后便未再暴露于分子A。

1個月和3個月研究中與受試物相關的發現：1個月研究中，中劑量組和/或高劑量組觀察到腋窩淋巴結、腸系膜淋巴結和脾臟大小輕微增加；而3個月研究中，未發現任何與受試物相關的微觀發現，1個月研究中的結果未在長期研究中重現。

結論

分子A的3個月研究未重現1個月研究中的毒理結果，也未見任何新的發現，因此未提供可供臨床參考的額外安全信息。ADA的形成導致大多數動物無法持續3個月暴露于藥物，在多數情況下實際上形成了非預期的恢復期，即給藥在繼續，但實際外周很快被清除，沒有藥物暴露，這也是1個月研究結果未重現的原因。

案例B：監管機構要求開展3個月研究

分子B的基本情況及1個月研究結果

分子B治療實體瘤。在NHP的1個月研究中，按50、500、4500μg/kg的劑量每周靜脈輸注給藥，每組6只動物（雌雄各半）。動物耐受良好，且觀察到了BiTE?分子活性的標志性特征。

中劑量組和高劑量組動物中，分別有60%和100%檢測到ADA，其中50%的ADA陽性動物藥物暴露量顯著降低。主要研究發現為：在ADA陰性的低劑量和中劑量動物中，垂體出現輕微至輕度的混合細胞炎癥浸潤。盡管高劑量組平均暴露量更高，但該劑量組100%動物均存在IgG型ADA，因此未觀察到這一變化。

另有1只動物的心臟和肺出現與血管損傷相關的變化，這與ADA相關免疫復合物可能介導的繼發效應一致：心臟中1條冠狀動脈周圍有肉芽腫性炎癥，肺中2條小肺動脈有血栓并部分阻塞管腔。這些變化與分子B并不直接相關，原因是：僅1只動物的少數血管出現該變化，研究中其他動物（包括藥物暴露量更高的動物）均無類似血管變化，且該變化與免疫復合物介導的血管損傷特征相符。

與監管機構的溝通及3個月研究的開展背景

安進向監管機構提出申請，認為3個月研究未必能發現更多毒性，原因如下：1）基于BiTE?分子的作用機制，其效應會急性顯現，且已在1個月研究中完成評估；2）2周探索性研究和1個月研究已充分表征分子安全性，盡管給藥時間延長，但1個月后未出現發現結果的進展；3）結合1個月研究中ADA的形成情況，動物可能無法在3個月研究期間維持穩定的藥物暴露。

然而，監管機構認為：1個月研究中雖出現ADA，但對分子B暴露量的影響較小，且主要局限于高劑量組；此外，動物未出現明確的超敏反應跡象，不影響繼續給藥；同時，盡管1個月研究中的發現極少，但無法排除長期暴露于分子B后出現新發現的可能（即便靶標表達水平預計不會隨時間升高），因此要求開展3個月研究。

3個月研究的設計及結果

3個月研究中，按50、4500μg/kg的劑量每周靜脈給藥，每組8只動物（雌雄各半）。低劑量組和高劑量組動物中分別有75%和50%產生ADA，但所有高劑量組動物及50%的低劑量組動物（2只ADA陽性、2只ADA陰性）均維持了足夠的藥物暴露。低劑量組中暴露量下降的動物（均為ADA陽性）從第30天起開始出現暴露量降低。

1個月研究中通過光學顯微鏡觀察到的與受試物相關的唯一發現（垂體浸潤），在3個月研究中也被觀察到，且發生率和嚴重程度均未增加。在1個月和3個月研究中，這些浸潤均表現為混合細胞或單核細胞浸潤：1個月研究的生存期結束時，觀察到混合細胞浸潤（提示急性炎癥過程）；而在1個月研究的恢復期結束時及3個月研究的治療期結束時，觀察到單核細胞浸潤（與慢性或消退期炎癥過程一致）。

此外，在給予分子B的動物中，多個組織觀察到發生率增加的微觀變化——盡管其組成、嚴重程度和分布與該物種常見的自發性浸潤相似，但仍歸因于靜脈給予外源性生物治療藥物和/或ADA的存在。這些變化包括：劑量≥50μg/kg時，多個組織出現輕微的單核細胞和/或混合細胞浸潤，主要表現為小灶性淋巴細胞浸潤，且呈血管周圍分布。

結論

分子B在1個月和3個月研究中的發現相似，未發現新的安全信息以支持臨床開發。

案例C：不同監管機構要求不同，導致3個月毒理研究的開展

1個月毒理研究情況

C分子是針對實體瘤靶點的藥物。NHPs 1個月毒理研究中，每組8只動物，設置0、5、5/15、5/30μg/kg四個劑量組（5/15μg/kg和5/30μg/kg指第1天給藥5μg/kg，第5天起給予更高劑量），于第1、5、12、19、26天給藥；高劑量組增設恢復組（每組2只/性別）。結果發現，動物可以耐受，呈現出BiTE?分子的典型活性特征。多個組織出現單核細胞至混合細胞浸潤及/或炎癥，且常呈血管周圍分布模式。低、中、高劑量組中，分別有86%、100%、75%的動物產生了ADAs；各劑量組分別有50%、71%、100%的動物出現明顯的藥物暴露量降低。

關于3個月研究的監管溝通與后續試驗

豁免3個月研究的申請及各方意見：以“基于1個月研究數據，預計3個月研究中ADA發生率高，可能導致暴露量損失”“1個月研究中，有ADAs的動物與無ADAs的動物相比，與受試物相關的光鏡下發現的發生率和/或嚴重程度有降低趨勢，提示3個月研究中ADA陽性動物可能暴露量降低，甚至在治療中也可能恢復”為由，請求監管機構豁免ICH S9推薦的3個月研究。最終，兩家監管機構同意豁免，一家不同意，其理由是“1個月研究中并非所有動物都產生了ADAs，部分動物可能在3個月給藥期間維持暴露量”“ADAs可能影響暴露量，但未必影響活性，3個月研究仍可能為安全性評估提供信息”。

3個月研究的開展及結果

因該分子擬全球銷售，安進公司開展了3個月研究，設置5、5/15、5/30μg/kg三個劑量組，所有動物（每組4只/性別）第1天均給予5μg/kg，第5天起每周一次給予5、15或30μg/kg，持續3個月。

藥物暴露情況：研究結束時，接受C分子治療的動物幾乎完全喪失藥物暴露，24只動物中僅2只（8%）在研究期間維持足夠暴露量（低劑量組和高劑量組各1只），其余動物在產生ADAs后從第30天起暴露量降低。

組織病理學發現：兩個研究周期結束時，均在各組織中觀察到免疫細胞浸潤，但3個月研究結束時，多數組織中浸潤的發生率或嚴重程度降低，這歸因于治療第一個月起ADA介導的暴露量長期降低，無意中模擬了恢復期。

結論

與1個月研究相比，3個月研究未發現新的靶組織，未揭示任何新的安全問題，也未發現現有毒理發現的惡化。

案例D：各監管機構完全同意豁免3個月毒理研究

1個月毒性研究情況

D分子是一款治療血液瘤的BiTE?分子。試驗設計：按性別分組，每組6只動物，采用靜脈給藥方式，于第1、5、12、19、26天給藥。設置兩個固定劑量組（低劑量組5μg/kg、中劑量組25μg/kg）和一個高劑量組（高劑量組采用初始遞增給藥方式：第1天5μg/kg，第5天50μg/kg，第8、12、19、26天250μg/kg）。結果如下：

ADA及暴露量情況：第26天，所有受測動物的ADAs均呈陽性；重復給藥后，所有動物的藥物暴露量均下降。在可測定的情況下，第26天給藥后5分鐘的血藥濃度僅為第1天（低、中劑量組）或第8天（高劑量組）同一時間點濃度的≤3%，表明所有動物的藥物暴露量快速降低。

耐受性及病理情況：中劑量組無法耐受，動物死亡和/或瀕死的原因是多方面的，包括ADA介導的血小板減少癥、骨髓細胞減少和/或菌血癥。在可耐受劑量下，主要觀察結果包括骨髓細胞減少，以及骨髓、淋巴結和脾臟中淋巴樣細胞增多的繼發性再生性改變。

PD標志物情況：1個月研究中，以靶RNA作為PD標志物評估該BiTE?分子在NHP中的活性。高劑量組動物在-1周時存在靶mRNA，到第12天顯著減少，第29天恢復至基線水平，這表明由于ADA介導的暴露量減少，治療的藥理學作用減弱。

關于3個月研究的監管溝通結果

豁免3個月研究的申請理由：安進公司提出，鑒于1個月研究中ADA發生率高，導致藥物暴露量降低，進而使得藥理學、藥效學和毒理學效應無法顯現。此外，PD標志物評估和組織病理學檢查表明，因ADAs導致暴露量減少后，相關效應已逆轉，因此開展3個月研究不會提升該分子的安全性評估效果。

監管機構意見：由于綜合數據集具有充分的說服力，所有被咨詢的監管機構均同意豁免D分子的3個月研究要求。

最后

根據ICH S6(R1)）要求，非臨床研究的目的包括確定人體初始安全劑量及后續劑量遞增方案、識別潛在靶器官毒性、明確動物毒性的可逆性、確定臨床監測的安全參數。按照ICH S9描述，對于多數晚期癌癥治療藥物，3個月非臨床研究被認為足以支持上市，這類亞慢性動物研究旨在揭示短期研究中未發現的潛在安全信號。

TCEs是通過激活T細胞發揮作用，激活過程在給藥后數小時內發生，極端情況下可引發嚴重細胞因子釋放綜合征。動物毒性研究中，靶組織的靶向效應可在給藥后數天至數周內出現，4周內即可充分表征靶器官毒性。因TCEs常快速導致細胞死亡，通常不會在2-3個月治療后出現關鍵組織的延遲毒性效應；當然，不排除一些特定情況，如靶標上調、慢性細胞死亡的長期后遺癥等。

安進公司分享的4個案例中，3個案例（A-C）開展了NHP 3個月毒理研究，其中A、C案例中，ADAs導致多數動物在研究期間暴露量不足。

A案例中，1個月研究顯示有限組織存在輕微發現，但3個月給藥后因完全喪失暴露量，未出現任何發現，未為臨床開發提供新安全信息；B案例通過“高劑量克服ADA”（即大量給藥抵消ADA介導的暴露量損失，維持藥效）實現了充分暴露，但1個月與3個月研究對比未發現新毒性；僅C案例的3個月研究有少量額外發現——雖僅2只動物維持3個月暴露。

所以，僅以ADA形成為由申請豁免研究尚不充分，申辦方需同時證明ADAs既影響暴露量，也影響藥物的藥理效應。這一點，案例D做的比較成功，最后所有監管機構同意豁免3個月毒理研究。

安進并非個例，行業普遍質疑ICH S9適應癥下TCEs的3個月研究必要性。IQ-DruSafe與IQ3Rs轉化預測科學工作組對多家藥企的調查顯示：TCEs非臨床毒性測試中，存在減少NHP使用的機會（不影響數據質量），包括個案豁免3個月研究。部分長期研究并無合理性，且不符合動物倫理。

一些替代方案與實施建議：若3個月研究無額外價值且不符合倫理，可考慮體外實驗（如人原代細胞、類器官、器官芯片）。這類方法目前雖然發展迅速，但還需關注下監管機構的接受度；建議早期與監管機構溝通，結合靶標現有數據、類似作用機制研究，采用證據權重法，避免開展無安全信息價值的NHP研究。

還有一點需要注意，監管機構之間意見也會存在不一致。案例C豁免3個月毒理研究的建議得到2家監管機構同意，1家反對。對于擬全球推廣的藥物，就只能就高不就低，按照要求最高的監管機構意見去落地。

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