細(xì)數(shù)延長(zhǎng)生物藥半衰期的各種策略

40多年前，隨著重組人胰島素和人生長(zhǎng)激素的出現(xiàn)，生物藥物的研發(fā)開始起步。當(dāng)時(shí)，這些藥物主要用于替代治療代謝或免疫疾病中涉及的天然蛋白質(zhì)，其在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期僅為幾小時(shí)，這一較短的半衰期在最初被當(dāng)作生物學(xué)事實(shí)所接受。與傳統(tǒng)小分子藥物的藥代動(dòng)力學(xué)（吸收、分布、代謝和排泄，即ADME）相比，早年對(duì)蛋白質(zhì)或肽類藥物快速消除的生物學(xué)機(jī)制的研究相當(dāng)有限。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著嵌合和人源化抗體特別是曲妥珠單抗等抗體藥物的出現(xiàn)，它們具有長(zhǎng)半衰期，可達(dá)1-3周（在小鼠中為6-8天），使人們對(duì)長(zhǎng)半衰期生物藥的研發(fā)興趣大增。IgG及其融合蛋白的長(zhǎng)半衰期不僅源于其“大塊頭”，還歸因于FcRn介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)循環(huán)機(jī)制，其循環(huán)時(shí)間比細(xì)胞因子和其他小到中等大小的生物藥物長(zhǎng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，聚乙二醇化（PEGylation）技術(shù)的發(fā)展，為延長(zhǎng)傳統(tǒng)蛋白質(zhì)藥物的半衰期，減緩腎臟消除，提供了另外一種路徑。這些基本原理的廣泛認(rèn)可，激發(fā)了其他幾種延長(zhǎng)生物治療藥物半衰期的技術(shù)的發(fā)明。到目前為止，已有超過50種基于不同半衰期延長(zhǎng)技術(shù)（Fc融合、PEG化、白蛋白融合等）的藥物獲批，并有大量藥物處于臨床前和臨床不同研發(fā)階段。如下表所示，*代表已撤市。

本文擬對(duì)延長(zhǎng)生物藥物半衰期的策略進(jìn)行詳細(xì)介紹。

聚乙二醇化技術(shù)

聚乙二醇化是一種通過將藥物與合成的親水性高分子聚合物進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，以增加其水動(dòng)力學(xué)體積，從而減緩腎臟清除、延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間的技術(shù)。

該技術(shù)的基本概念最早可追溯到20世紀(jì)50年代。在早期研究中，肽胺類藥物甘氨酰-L-亮氨酰-美斯卡林與血漿擴(kuò)容劑聚乙烯吡咯烷酮結(jié)合，以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的停留時(shí)間，并實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢酶催化釋放。盡管當(dāng)時(shí)也提出了將這種方法應(yīng)用于合成內(nèi)源性肽激素（如催產(chǎn)素或加壓素），但這一方法并未進(jìn)入臨床實(shí)踐。

20年后，在重組生物藥物出現(xiàn)之前，研究發(fā)現(xiàn)將甲氧基聚乙二醇與牛血清白蛋白和牛肝過氧化氫酶結(jié)合，可以降低動(dòng)物免疫反應(yīng)，延長(zhǎng)半衰期。這些研究的作者Frank Davis博士和他的博士生Abraham Abuchowski隨后創(chuàng)立了Enzon制藥公司，旨在將“聚乙二醇化”從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。

Enzon公司首批獲得FDA批準(zhǔn)的產(chǎn)品是非人類酶類藥物：pegademase（Adagen?），一種聚乙二醇化的牛腺苷脫氨酶，用于酶替代療法，于1990年獲批；以及pegaspargase（Oncaspar?），一種聚乙二醇化的來自大腸桿菌的天冬酰胺酶（ASNase），用于治療對(duì)天冬酰胺酶天然制劑產(chǎn)生過敏反應(yīng)的急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）患者，于1994年獲批。這兩款藥物均是通過表面賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)與多個(gè)5 kDa的聚乙二醇鏈進(jìn)行隨機(jī)結(jié)合，有效地屏蔽了人體免疫系統(tǒng)，從而減少了抗體反應(yīng)和蛋白降解，延緩了腎臟清除，使得pegademase可以每周給藥一次，而pegaspargase可以每?jī)芍芙o藥一次。

Enzon公司開發(fā)的下一個(gè)產(chǎn)品是聚乙二醇化的重組干擾素α2b（IFNα2b）。通過將單個(gè)12 kDa的線性聚乙二醇以琥珀酰亞胺碳酸酯的形式與IFNα2b進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，得到了藥物peginterferon alfa-2b（PegIntron?），該藥物于2000年獲得FDA批準(zhǔn)用于治療丙型肝炎。Peginterferon α2a（Pegasys?）采用了Shearwater技術(shù)，通過將分支的40 kDa N-羥基琥珀酰亞胺激活的聚乙二醇與干擾素α2a（IFNα2a）的賴氨酸側(cè)鏈結(jié)合，于一年后獲得FDA批準(zhǔn)用于相同適應(yīng)癥。

對(duì)這兩種聚乙二醇化干擾素版本的比較表明，連接化學(xué)和聚合物結(jié)構(gòu)都可以顯著影響PK和PD特性。Peginterferon alfa-2b在人體內(nèi)的血漿半衰期為27.2-39.3小時(shí)，而未修飾的IFN約為2小時(shí)，并作為異構(gòu)體混合物在體外保持了28%的活性。相比之下，peginterferon α2a的半衰期為61-110小時(shí)，但其在體外的活性已降至僅7%。Peginterferon alfa-2b從皮下注射部位迅速吸收（t1/2 = 4.6小時(shí)），而peginterferon α2a進(jìn)入血液的釋放顯著延遲（t1/2 = 50小時(shí)）。此外，peginterferon alfa-2b的生物分布與自然IFN相似（VD = 31-73小時(shí)），而peginterferon α2a的平均表觀分布容積減少到6-14 L，這很可能與更龐大的分支40 kDa聚乙二醇鏈有關(guān)。盡管如此，這兩種生物藥物在治療丙型肝炎方面都顯示出了療效，其中peginterferon α2a達(dá)到了更高的總體持續(xù)抗病毒反應(yīng)。

聚乙二醇化技術(shù)在早期成功應(yīng)用的基礎(chǔ)上，多年來不斷發(fā)展和完善。例如，在制備聚乙二醇化干擾素β-1a（Plegridy?）和聚乙二醇化粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF，商品名Neulasta?）時(shí)，采用了醛化學(xué)方法，在低pH條件下選擇性地將20 kDa的線性PEG鏈與N末端肽氨基基團(tuán)結(jié)合。而對(duì)于抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）Fab片段certolizumab pegol（Cimzia?），則通過工程化的未配對(duì)巰基基團(tuán)，使用馬來酰亞胺化學(xué)方法位點(diǎn)特異性地結(jié)合了分支的40 kDa PEG。這兩種方法都使得藥物制劑更加均一。

另一種實(shí)現(xiàn)PEG聚合物位點(diǎn)特異性結(jié)合的策略是通過引入非天然氨基酸。利用其專有的ReCODE?技術(shù)，Ambrx公司開發(fā)了ARX201，這是一種重組人生長(zhǎng)激素（hGH），在35位通過琥珀終止密碼子抑制引入了單個(gè)對(duì)乙酰基-L-苯丙氨酸殘基。然后將30 kDa的PEG鏈與其正交反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合，得到了單一的聚乙二醇化hGH。與WHO的hGH標(biāo)準(zhǔn)相比，ARX201在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的生物活性僅降低了約5倍，而在大鼠中的血漿半衰期增加了約9倍。然而，在2期臨床試驗(yàn)后，由于臨床前靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究表明PEG成分在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中累積，開發(fā)被終止。

另一種聚乙二醇化hGH（PHA-794428）采用N末端結(jié)合40 kDa分支PEG，顯示出約20倍的受體親和力降低，但在每周給藥去垂體大鼠時(shí)，與每日給藥的hGH相比，誘導(dǎo)了相似的體重增加。該產(chǎn)品由于在2期臨床后期觀察到注射部位脂肪萎縮而終止開發(fā)。最近，lonapegsomatropin（Skytrofa?），一種每周一次的聚乙二醇化hGH，獲得了FDA批準(zhǔn)。該分子是通過一個(gè)可自水解的所謂TransCon?連接子，將四臂PEG與hGH結(jié)合。除了由于其增加的水動(dòng)力學(xué)體積而具有更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間外，這種修飾的hGH由于表面附著的雙分支PEG的空間干擾而沒有受體結(jié)合活性，從而也減少了受體介導(dǎo)的清除。然而，在血液pH和體溫下，PEG連接子會(huì)穩(wěn)定水解，導(dǎo)致生物活性激素的持續(xù)釋放。因此，在臨床開發(fā)期間未觀察到注射部位的脂肪萎縮和PEG空泡化。同樣的聚乙二醇化技術(shù)最近被應(yīng)用于甲狀旁腺激素（PTH，1-34殘基）肽，以開發(fā)長(zhǎng)效的palopegteriparatid（TransCon PTH），用于治療成人甲狀旁腺功能減退癥，并于2024年獲得FDA批準(zhǔn)，商品名為Yorvipath?。

為了減少黏度、進(jìn)一步改善藥代動(dòng)力學(xué)或規(guī)避免疫識(shí)別，已經(jīng)提出了幾種創(chuàng)新的PEG衍生物，例如由Holger Frey博士最近合成的一種結(jié)構(gòu)上“隨機(jī)化”的、多分支的PEG鏈。另一個(gè)例子是來自Polytherics（后來與Antitope合并，現(xiàn)為Abzena）的PolyPEG?技術(shù)。這種聚合物將PEG鏈連接到聚甲基丙烯酸酯主鏈的重復(fù)單元上，從而形成類似梳子的結(jié)構(gòu)。與線性30 kDa PEG結(jié)合物相比，70 kDa PolyPEG與IFNα2a結(jié)合后的黏度約降低了3倍，在大鼠中的終末半衰期延長(zhǎng)了一倍。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的效力比30 kDa PEG版本低約13倍，僅為天然IFN生物活性的0.5%。

聚乙二醇化技術(shù)的局限性主要體現(xiàn)在可能導(dǎo)致藥理學(xué)活性的降低，且?guī)硪恍┌踩燥L(fēng)險(xiǎn)，比如注射部位脂肪萎縮和細(xì)胞質(zhì)空泡化等。還有一點(diǎn)需要注意，聚乙二醇化的最初想法是降低免疫原性，特別是對(duì)于非人類來源的蛋白質(zhì)，但近年來越來越明顯的是，PEG本身可以觸發(fā)免疫反應(yīng)。這可能導(dǎo)致通過抗PEG抗體加速聚乙二醇化藥物的血漿清除，或激活補(bǔ)體系統(tǒng)。這點(diǎn)是在COVID-19大流行之后開始受到關(guān)注，因?yàn)榇蠖鄶?shù)疫苗使用PEG屏蔽的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）進(jìn)行mRNA遞送，并且報(bào)告了幾例與COVID-19 mRNA疫苗Corminaty?和Spikevax?接種相關(guān)的PEG相關(guān)過敏性反應(yīng)。事實(shí)上，PEG特異性抗體可以通過這種mRNA疫苗接種被誘導(dǎo)或增強(qiáng)，這可能會(huì)影響其他基于PEG的藥物的清除。

聚乙二醇的替代品

近年來，已有多種其他天然或化學(xué)合成的聚合物被提議作為PEG模擬物。這些大分子與PEG具有相似的生物物理特性，例如分子量大、在水性環(huán)境中溶解度高，且有望克服PEG的一些缺陷，如免疫原性和組織蓄積性。

其中一個(gè)例子是線性或超支化聚甘油（PG），它通過乙氧基乙基縮水甘油醚的陰離子開環(huán)聚合獲得。一種40kDa的聚甘油與IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra，阿那白滯素）結(jié)合后，其半衰期與聚乙二醇化蛋白相似，且在動(dòng)物中表現(xiàn)出比聚乙二醇化更低的免疫原性和更長(zhǎng)的血漿半衰期。不過，聚甘油一般不能被體內(nèi)的內(nèi)源性酶降解。

聚肌氨酸可能是一種很有前景的可生物降解合成聚合物。肌氨酸（N-甲基甘氨酸，Sar）是一種非蛋白氨基酸，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)作為膽堿代謝的中間產(chǎn)物存在。有研究顯示，聚肌氨酸-干擾素較PEG類似物具備相似的半衰期，但藥效更強(qiáng)，且免疫原性更低。

還有些其他類型的人工多肽樣聚合物，與聚乙二醇化生物制劑相比，具有可生物降解性、更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性并降低免疫原性。例如，人工α-螺旋多肽L-P(EG3Glu)——基于聚谷氨酸，其γ-羧酸鹽基團(tuán)被修飾為帶有短PEG鏈的（不帶電荷的）酯，這種修飾被稱為PEPylation；還有所謂的高兩性離子密度多肽，如羧基甜菜堿功能化多肽（PepCB）。L-P(CB-EG3Glu)是一種帶有羧基甜菜堿側(cè)鏈的L-P(EG3Glu)，用于修飾細(xì)菌L-天冬酰胺酶II，形成類似海膽的大分子結(jié)構(gòu)。這種結(jié)合物的流體動(dòng)力學(xué)大小與隨機(jī)偶聯(lián)5kDa甲氧基聚乙二醇（mPEG）的天冬酰胺酶相似，與未修飾的酶相比，在大鼠中的血漿半衰期增加了約20倍。與聚乙二醇化版本相比，L-P(CB-EG3Glu)-天冬酰胺酶在反復(fù)給藥后幾乎不會(huì)引發(fā)抗天冬酰胺酶或抗聚合物抗體。

雖然這些方法在合成聚合物設(shè)計(jì)領(lǐng)域確實(shí)令人關(guān)注，但它們都涉及復(fù)雜的化學(xué)合成過程，且到目前為止均未進(jìn)入臨床階段。合成聚合物與生物藥物成分的化學(xué)偶聯(lián)需要額外的加工和純化步驟，這會(huì)降低產(chǎn)量并增加生產(chǎn)制造成本，而且對(duì)于產(chǎn)品分析（特別是對(duì)于具有多分散組成的聚合物）所需的額外工作也是挑戰(zhàn)。

與這些合成方法相比，天然多糖提供了另一類有趣的親水性聚合物，可用于增加治療性蛋白質(zhì)的分子大小或?qū)ζ溥M(jìn)行屏蔽。事實(shí)上，某些細(xì)菌病原體合成的莢膜碳水化合物在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多糖相似甚至相同，這有助于它們逃避免疫系統(tǒng)。這類非免疫原性、可生物降解的碳水化合物包括多唾液酸、硫酸乙酰肝素前體、透明質(zhì)酸和軟骨素，它們都已被評(píng)估為PEG的替代品，不再逐一細(xì)表。

高糖基化

天然糖蛋白上的碳水化合物部分不僅會(huì)影響溶解度和穩(wěn)定性等生物物理特性，還會(huì)通過調(diào)節(jié)受體親和力和外周清除率對(duì)生物活性產(chǎn)生顯著影響。以人促紅細(xì)胞生成素（EPO）為例，天然EPO含有3個(gè)N-連接和1個(gè)O-連接糖基化位點(diǎn)，由不同糖型的異質(zhì)混合物組成，糖鏈末端的唾液酸殘基數(shù)存在差異。通過在30位和88位引入兩個(gè)額外的含唾液酸碳水化合物的N-連接糖基化位點(diǎn)，研發(fā)出了高糖基化EPO類似物——darbepoetinalfa（阿法達(dá)貝泊汀，Aranesp?）。在透析患者中靜脈注射后，這種修飾后的人EPO終末半衰期延長(zhǎng)了3倍（26.3小時(shí)vs 8.5小時(shí)）。半衰期延長(zhǎng)很可能是由于分子大小增加以及額外唾液酸殘基帶來的負(fù)電荷升高，導(dǎo)致其與帶負(fù)電荷的腎小球基底膜相互排斥，從而延緩腎臟過濾。

人絨毛膜促性腺激素（CG）是另一種帶強(qiáng)負(fù)電荷的天然糖蛋白，在人體中的血漿半衰期異常長(zhǎng)，為32-33小時(shí)。其循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)是由β亞基富含脯氨酸/絲氨酸的羧基末端肽（CTP）介導(dǎo)的，該肽包含28個(gè)殘基，帶有4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，且均帶有末端唾液酸基團(tuán)。通過將促卵泡生成素（FSH）的β鏈與1個(gè)CTP肽融合，得到了長(zhǎng)效FSH類似物corifollitropinalfa（促卵泡素α，Elonva?），于2014年在美國(guó)上市。與CTP融合不會(huì)干擾FSH與受體的結(jié)合，但會(huì)使人體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)2-3倍，這對(duì)接受體外受精的女性來說是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，無(wú)需每天注射7次，單次皮下注射即可滿足卵巢刺激需求。

最近，長(zhǎng)效人生長(zhǎng)激素somatrogon-ghla（Ngenla?）已獲批作為每周一次的治療藥物，用于患有生長(zhǎng)激素缺乏癥（GHD）的兒科患者。在該藥物中，人生長(zhǎng)激素與多個(gè)CTP肽融合，N端1個(gè)，C端串聯(lián)重復(fù)1個(gè)，與常規(guī)重組人生長(zhǎng)激素相比，在GHD兒童中半衰期延長(zhǎng)5-10倍。

因此，對(duì)于希望適度延長(zhǎng)半衰期且高負(fù)電荷不構(gòu)成問題的生物藥物，高糖基化似乎頗具前景。特別是CTP融合技術(shù)，由于患者耐受性良好，可能具有更廣泛的應(yīng)用。然而，與所有糖蛋白一樣，這些融合蛋白需要使用真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，且最終得到的藥物制劑具有異質(zhì)性，附著的碳水化合物數(shù)量和組成存在差異，這就需要在純化和產(chǎn)品分析方面投入更多精力。

基于重組氨基酸的生物聚合物

作為聚乙二醇的另一類替代物，近年來出現(xiàn)了多種利用基因編碼多肽的方法。這類方法均由天然蛋白源L-氨基酸的特定子集組成，旨在設(shè)計(jì)出與PEG具有或多或少相似生物物理特性的重組生物聚合物。原則上，治療性蛋白質(zhì)或多肽與這類結(jié)構(gòu)無(wú)序多肽的基因融合，可直接得到具有固定氨基酸序列和長(zhǎng)度的均一制劑，無(wú)需化學(xué)修飾或偶聯(lián)步驟。這一特性使這些基因編碼生物聚合物有別于其它所有天然或（半）合成大分子。

PASylation?技術(shù)是將藥物與由天然小分子氨基酸脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）和/或絲氨酸（Ser）組成的特定重復(fù)多肽序列進(jìn)行基因融合（或化學(xué)偶聯(lián)），該序列在生理緩沖條件下形成無(wú)規(guī)卷曲，與PEG的生物物理特性高度相似。與PEG一樣，這種無(wú)結(jié)構(gòu)、生化惰性、強(qiáng)親水性但不帶電荷的生物聚合物能增大蛋白質(zhì)或多肽的流體動(dòng)力學(xué)體積，從而顯著延緩腎臟和眼部清除，并增強(qiáng)體內(nèi)藥物效力。與PEG不同的是，PAS生物聚合物已被證明在動(dòng)物體內(nèi)可生物降解且無(wú)免疫原性，并且能在微生物表達(dá)系統(tǒng)中以每升數(shù)克的產(chǎn)量高效生產(chǎn)，形成鏈長(zhǎng)可達(dá)1200個(gè)殘基的單分散多肽——其中PAS（800）的特性與40kDa PEG大致相當(dāng)。

PAS技術(shù)應(yīng)用已經(jīng)比較廣泛。例如，瘦素與600個(gè)殘基的PAS序列（PAS600）融合后，在小鼠體內(nèi)的血漿半衰期延長(zhǎng)了45倍（從26分鐘延長(zhǎng)至20小時(shí)），這使其穿過血腦屏障后，在下丘腦引起的STAT3磷酸化顯著增強(qiáng)且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。盡管受體親和力降低了7倍，但在Lep ob/ob小鼠中，注射4次PAS（600）-瘦素后，體重減少了40%以上，代謝狀態(tài)也恢復(fù)正常，且無(wú)任何不良反應(yīng)；相比之下，在該小鼠疾病模型中，以相同摩爾劑量注射未修飾的重組瘦素，與溶媒組相比幾乎無(wú)效。

除了這些臨床前研究外，一種PAS化天冬酰胺酶（JZP-341）已經(jīng)進(jìn)入實(shí)體瘤1期臨床試驗(yàn)。此外，一種PAS化的89Zr標(biāo)記抗HER2 Fab片段被用于一名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像，成功識(shí)別出先前未檢測(cè)到的小原發(fā)腫瘤病灶。

另一種基于更多種天然氨基酸（P、E、S、T、A、G）的氨基酸聚合物，稱為XTEN?，被設(shè)計(jì)為無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)的非重復(fù)多肽，帶有多個(gè)負(fù)電荷（由于谷氨酸殘基含量高）。Efanesoctocog alfa（ALTUVIIIO?）基于B結(jié)構(gòu)域缺失的單鏈重組凝血因子VIII（rFVIII），是首個(gè)（也是迄今為止唯一一個(gè)）XTEN融合蛋白，于2023年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于治療遺傳性A型血友病。

最近，XTEN被用于暫時(shí)屏蔽抗體片段的結(jié)合位點(diǎn)，并構(gòu)建包含蛋白酶可切割連接子的前藥蛋白。通過這種方式，Amunix公司開發(fā)了一種新型雙特異性T細(xì)胞連接器（TCE）融合蛋白，包含兩個(gè)單鏈可變片段（scFv），一個(gè)靶向CD3，另一個(gè)靶向腫瘤相關(guān)抗原。在這種方法中，融合蛋白在健康組織和血液中被XTEN部分功能性阻斷——同時(shí)介導(dǎo)延長(zhǎng)循環(huán)——但一旦進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，通過細(xì)胞外基質(zhì)中局部激活的蛋白酶切割XTEN而被激活。憑借基于這種條件激活生物制劑的免疫腫瘤學(xué)研發(fā)管線，Amunix公司于2021年被賽諾菲收購(gòu)。

考慮到XTEN序列的高內(nèi)在負(fù)電荷會(huì)降低藥理活性成分的結(jié)合活性，并阻礙組織穿透（由于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)陰離子的排斥），研究人員構(gòu)建了一種相關(guān)的無(wú)結(jié)構(gòu)但不帶電荷的多肽，稱為PsTag。為此，排除了谷氨酸（E），并使用重復(fù)序列單元，這與XTEN不同，但與PAS化相似。將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）21與這種600個(gè)殘基的PsTag序列融合后，F(xiàn)GF21在小鼠體內(nèi)的血漿半衰期從0.34小時(shí)延長(zhǎng)至12.9小時(shí)。這種分子的衍生物PsTag-FGF21（V169L）在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中顯示出療效。PsTag也被用于屏蔽蛋白酶可激活的雙特異性T細(xì)胞銜接器。遺憾的是，尚未公開PsTag與XTEN的直接對(duì)比數(shù)據(jù)。

另一種方法是基于纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-Xaa-甘氨酸五肽重復(fù)序列構(gòu)建人工彈性蛋白樣多肽（ELP），其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。ELP的獨(dú)特之處在于其會(huì)發(fā)生可逆的溫度依賴性相變，這由Xaa位置的殘基決定。因此，ELP經(jīng)過工程設(shè)計(jì)后在室溫下可溶，但在體溫下會(huì)聚集，形成凝膠狀狀態(tài)。這種相分離特性不僅可用于純化融合蛋白，還為治療應(yīng)用中的短暫儲(chǔ)庫(kù)制劑提供了可能。基于這項(xiàng)技術(shù)，PhaseBio制藥公司開發(fā)了多種長(zhǎng)效肽，并進(jìn)入臨床階段，包括Vasomera?——一種ELP化血管活性腸肽（VIP），以及Glymera?。

一種稱為EKylation的方法涉及將藥理活性蛋白或多肽與由谷氨酸和賴氨酸組成的交替電荷（兩性離子）氨基酸序列進(jìn)行基因融合。最初，β-內(nèi)酰胺酶及其不穩(wěn)定突變體TEM-19的C端與10kDa和30kDa EK多肽融合。雖然保留了催化活性，并觀察到熱耐受性和耐鹽性顯著增強(qiáng)，但尚未公布此類或其他類似類型融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

Fc融合蛋白

首個(gè)帶有免疫球蛋白（Ig）Fc片段的融合蛋白是由DanielJ.Capon博士于1989年首次提出的，當(dāng)時(shí)是為了設(shè)計(jì)一種針對(duì)HIV感染中病毒包膜蛋白gp120的阻斷劑，其中Fc融合的作用包括：1）溶解易聚集的受體胞外區(qū)；2）利用Fc部分的同源二聚體特性改善親和力；3）提高在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量；4）通過蛋白A親和層析便于純化；5）實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)的半衰期。

此后，F(xiàn)c融合技術(shù)成為繼PEG化之后，改善藥理活性和肽類藥代動(dòng)力學(xué)特性的第二大成功策略。

Fc融合蛋白的循環(huán)延長(zhǎng)主要通過內(nèi)體回收介導(dǎo)，這是一種自然機(jī)制，使IgG1、IgG2和IgG4亞類抗體在人類中的血漿半衰期極長(zhǎng)，約為21天。與抗體類似，F(xiàn)c融合蛋白通過胞飲作用被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化，但并非在溶酶體中降解，而是在酸性內(nèi)體環(huán)境（pH≤6.5）中，F(xiàn)c部分與FcRn結(jié)合；隨后，融合蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞表面，在生理pH（≈7.4）下復(fù)合物解離，再次釋放到血液中。

比如依那西普（Etanercept，Enbrel?），一款腫瘤壞死因子（TNF）-α受體（TNFR2，又稱p75）與IgG1 Fc的融合蛋白，于1998年獲批用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）治療。RA患者中其血漿半衰期約為4天（70小時(shí)），可每周給藥1-2次。但其半衰期（4天）顯著短于完整重組IgG1抗體（如同樣阻斷TNF-α的阿達(dá)木單抗，半衰期15-19天），原因可能是FcRn結(jié)合位點(diǎn)（靠近抗體鉸鏈區(qū)）的構(gòu)象變化或空間位阻，導(dǎo)致受體親和力降低，內(nèi)體回收效率下降。事實(shí)上，依那西普與FcRn的親和力約為阿達(dá)木單抗的1/4，且與靶標(biāo)TNF-α結(jié)合后，對(duì)FcRn的親和力會(huì)進(jìn)一步降低。

已知抗體Fc區(qū)中，在酸性（而非中性）pH下增強(qiáng)FcRn親和力的突變可改善工程化IgG的藥代動(dòng)力學(xué)。比如，人α1-抗胰蛋白酶（AAT）-Fc融合蛋白INBRX-101（SAR447537）通過工程化提高FcRn親和力，在AAT缺乏癥成人中，其末端消除半衰期可達(dá)15.7-18.2天，與天然IgG接近。索塔西普（Sotatercept，Winrevair?），一款近期獲批用于肺動(dòng)脈高壓（PAH）治療的藥物，是由人激活素受體IIA（ActRIIA）胞外區(qū)與IgG1 Fc連接的同源二聚體Fc融合蛋白，在健康人中半衰期約23天，這也得益于Fc工程化改造。

此外，還要考慮目的蛋白與Fc之間連接子的重要性，主要影響蛋白活性。以度拉糖肽（Dulaglutide，Trulicity?）為例，DPP-IV保護(hù)的GLP-1（7-37）類似物與IgG4 Fc的融合蛋白，獲批用于II型糖尿病治療。當(dāng)GLP-1衍生物通過天然鉸鏈區(qū)與IgG1 Fc融合時(shí)，體外活性較游離肽降低95%；而通過優(yōu)化連接子長(zhǎng)度和序列，選擇IgG4亞型的Fc，效力提升4倍。其在人體中的血漿半衰期為4.7天，可每周給藥一次。還要注意的是，連接子還可能導(dǎo)致Fc融合蛋白對(duì)蛋白水解敏感。例如，依那西普對(duì)克羅恩病無(wú)效，因這類患者體內(nèi)激活的基質(zhì)金屬蛋白酶上調(diào)，會(huì)切割鉸鏈區(qū)的IgG和Fc融合蛋白。

Fc融合蛋白已經(jīng)有很多技術(shù)平臺(tái)。比如Genexine的hyFc技術(shù)平臺(tái)，通過人IgD的高柔性鉸鏈區(qū)將治療性蛋白與IgG4的Fc連接，避免因空間位阻導(dǎo)致的結(jié)合活性損失。又如Hamni的LAPSCOVERY?技術(shù)，使用合成PEG連接子共價(jià)連接Fc部分與藥理活性成分，以防止活性或FcRn結(jié)合能力損失，并最小化免疫原性。另外，F(xiàn)c融合蛋白不只有同源二聚體，Syntonix Pharmaceuticals開發(fā)了Fc融合單體技術(shù)，很多Fc偶聯(lián)凝血因子，如依特諾凝血素α（rFIX-Fc，Alprolix?）、依莫凝血素α（rFVIII-Fc，Eloctate?）等均屬此類。

白蛋白融合蛋白與偶聯(lián)物

人血清白蛋白（HSA）是肝細(xì)胞大量合成的66.5kDa蛋白（每日約14g），是血液中最豐富的蛋白，濃度為35-50mg/mL。在血漿中，它不僅作為兩性電解質(zhì)和滲透劑，還充當(dāng)多種生理相關(guān)化合物的載體，如激素（孕酮、睪酮、甲狀腺激素等）、膽紅素，尤其是多種脂肪酸。HSA在人體具有極長(zhǎng)的血漿半衰期（19天），部分原因是其較大的分子量和生理pH下的凈負(fù)電荷（等電點(diǎn)5.9）減少了腎臟清除；更重要的原因是內(nèi)體回收機(jī)制——HSA與FcRn的結(jié)合方式類似免疫球蛋白，但結(jié)合界面與Fc部分不同。

白蛋白融合蛋白延長(zhǎng)半衰期的案例很早就已經(jīng)出現(xiàn)。1992年發(fā)現(xiàn)，CD4胞外區(qū)與HSA融合后，在兔子中的消除半衰期延長(zhǎng)140倍。但首個(gè)重組白蛋白融合蛋白阿必魯肽（albiglutide，Eperzan?/Tanzeum?）直到20多年后才獲批，用于2型糖尿病治療——它由兩個(gè)DPP-4抗性GLP-1類似物串聯(lián)偶聯(lián)于HSA的C端，將GLP-1拮抗劑的半衰期從幾分鐘延長(zhǎng)至6-8天，實(shí)現(xiàn)每周給藥。該藥物最初被證實(shí)安全且能有效控制血糖，甚至降低心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，但因競(jìng)爭(zhēng)不過Fc融合蛋白度拉糖肽和脂肪酸偶聯(lián)物利拉魯肽、銷售不佳，且疊加FDA對(duì)過敏反應(yīng)和甲狀腺C細(xì)胞腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的警告，于2017年停產(chǎn)。

目前唯一上市的白蛋白融合蛋白：albutrepenonacogalfa（Idelvion?）于2016年獲FDA批準(zhǔn)，用于血友病B治療。通過白蛋白融合，其半衰期延長(zhǎng)至102小時(shí)，是傳統(tǒng)重組FIX的4.3倍。

那么，為什么白蛋白融合蛋白臨床轉(zhuǎn)化成功率那么低呢？原因主要包括：1）生產(chǎn)難度大：HSA結(jié)構(gòu)復(fù)雜（含17個(gè)二硫鍵和1個(gè)暴露的游離半胱氨酸），需畢赤酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)正確折疊；若融合的活性蛋白本身也有復(fù)雜的二硫鍵結(jié)構(gòu)，情況會(huì)更糟；2）種屬差異影響臨床前評(píng)價(jià)：小鼠FcRn不結(jié)合人HSA，而內(nèi)源性小鼠白蛋白在pH6時(shí)與人FcRn的親和力約強(qiáng)5倍。因此，即使表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠，也因小鼠白蛋白的競(jìng)爭(zhēng)而不適合作為人HSA融合蛋白的臨床前模型。需構(gòu)建同時(shí)表達(dá)人FcRn和白蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，以開展藥代動(dòng)力學(xué)研究；3）內(nèi)源性HSA的競(jìng)爭(zhēng)：融合蛋白對(duì)FcRn的結(jié)合僅受輕微影響，但內(nèi)源性HSA濃度（至少高三個(gè)數(shù)量級(jí)）遠(yuǎn)高于治療性融合蛋白，因體內(nèi)受體數(shù)量有限，未結(jié)合的白蛋白最終在溶酶體降解，可能阻礙融合蛋白的內(nèi)體回收。例如，G-CSF-HSA融合蛋白balugrastim在III期臨床試驗(yàn)中的終末半衰期僅35.5小時(shí)，甚至短于PEG化G-CSF（45.3小時(shí)）。

改善白蛋白融合蛋白半衰期的策略之一是工程化HSA變體提高FcRn親和力。例如，三重突變（E505Q/T527M/K573P）使HSA與多種蛋白（如broculizumab、GST、rFVII）的融合蛋白在pH5.5時(shí)對(duì)人FcRn的親和力提高168-353倍。其中，rFVII融合蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠中的半衰期是普通白蛋白融合蛋白的3.6倍。

策略之二是與白蛋白的非共價(jià)結(jié)合。部分生物藥與白蛋白共價(jià)融合后會(huì)出現(xiàn)活性損失，例如FIX、IFNα2b和GLP-1，原因主要是白蛋白的體積較大導(dǎo)致空間位阻，或干擾蛋白折疊。為解決這一問題，研究人員開發(fā)了非共價(jià)結(jié)合白蛋白的策略，而非共價(jià)連接，具體包括兩種方式：1）通過化學(xué)連接脂質(zhì)烴鏈，利用白蛋白的天然脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)；2）與具有白蛋白結(jié)合活性的小蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因融合。

先看下脂質(zhì)化（Lipidation）方式。脂質(zhì)化即通過化學(xué)酰化將脂肪酸連接至肽或蛋白藥物，使其與白蛋白短暫結(jié)合，從而延長(zhǎng)血漿半衰期。目前已有多種脂質(zhì)化療法獲批，主要包括胰島素衍生物、GLP-1類似物、hGH等。比如，每日給藥一次的脂質(zhì)化GLP-1類似物利拉魯肽（liraglutide，Victoza?），其N端可被DPP-4切割，但與白蛋白形成復(fù)合物后，空間位阻部分保護(hù)其免受DPP-4降解，從而延長(zhǎng)生物活性。此外，長(zhǎng)鏈酰化肽可在皮下注射部位自發(fā)寡聚化，延緩吸收。每周給藥一次的GLP-1類似物司美格魯肽（semaglutide，Ozempic?）通過兩點(diǎn)優(yōu)化實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效：用2-氨基異丁酸（Aib）替代Ala-8以避免DPP-4切割；連接比利拉魯肽更長(zhǎng)的C18脂肪酸（利拉魯肽為C16），增強(qiáng)與HSA的復(fù)合物形成。但其開發(fā)需平衡脂肪酸和連接子的組合，以最大化白蛋白結(jié)合能力同時(shí)保留對(duì)GLP-1受體（GLP-1R）的親和力，過程頗具挑戰(zhàn)。

再看下與白蛋白結(jié)合域（ABD）的基因融合。除脂質(zhì)化外，另一種非共價(jià)結(jié)合HSA的策略是將藥理活性成分與具有白蛋白結(jié)合活性的小蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因融合。鏈球菌蛋白G的ABD最初作為細(xì)菌表面蛋白被發(fā)現(xiàn)，可通過結(jié)合血漿蛋白為病原體提供“偽裝”。ABD首次被用于延長(zhǎng)血漿半衰期的研究，是與可溶性補(bǔ)體受體1型、抗Her2 Fab片段及單鏈雙抗體融合，在動(dòng)物模型中驗(yàn)證了效果。如靶向PCSK9的Anticalin?蛋白與ABD融合后，在大鼠中的血漿半衰期延長(zhǎng)24倍，并進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。

當(dāng)然，還有一些其他非共價(jià)結(jié)合策略，比如抗HSA納米抗體技術(shù)、蛋白支架等，篇幅所限，不再一一贅述。

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