Cell?| 5000份腦脊液樣本揭示多發性硬化診斷新突破——血腦屏障功能障礙是腦脊液蛋白組變異的首要來源

撰文 | 言笑

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經系統的慢性炎性脫髓鞘疾病，影響著全球近300萬人。目前， MS的診斷主要依賴于 McDonald 標準 （國際公認的多發性硬化診斷指南，由國際專家小組制定并定期更新。其核心邏輯是在排除其他疾病的前提下，通過證明病灶的“空間多發性”（中樞神經系統不同部位受損）和“時間多發性”（病情反復發作或MRI顯示新舊病灶并存）來確立診斷） ， 其中腦脊液中的寡克隆帶（oligoclonal bands，OCBs）是最核心的生物學標志物【1】。然而，這一診斷體系存在顯著的“灰色地帶”：約10-20%的患者表現為OCB陰性，導致臨床鑒別診斷極為困難——他們可能被誤診為其他炎性疾病或被漏診【2-4】。而現有的替代標志物如k游離輕鏈（kappa free light-chain,kFLC）雖然在總體人群中表現尚可，但在OCB陰性個體中敏感度不足，無法解決這一臨床困境【5-6】。另一方面，MS的疾病進程存在顯著異質性，從復發緩解型（RRMS）向繼發進展型（SPMS）的轉化時機難以預測，而新興的進展靶向治療（如tolebrutinib）又需要早期識別可能獲益的患者，但傳統的臨床指標（復發史、MRI病灶負荷、殘疾評分）預測價值有限，往往需要長期隨訪才能做出判斷。那么，能否通過腦脊液蛋白質組的深度解析，找到能夠解決上述臨床痛點的分子標志物呢？

近日，來自德國馬普生化研究所的Matthias Mann團隊聯合慕尼黑工業大學的Bernhard Hemmer團隊和Christiane Gasperi團隊在Cell雜志發表了一篇題為Large-scale proteomics across neurological disorders uncovers biomarker panel and targets in multiple sclerosis的研究論文。作者通過先進的質譜技術，對超過5000份腦脊液樣本進行了深度蛋白質組學分析，首次闡明血腦屏障功能障礙是腦脊液蛋白組變異的首要來源，其影響遠超疾病本身；在此基礎上開發的22蛋白標志物組合，在OCB陰性的MS患者中診斷性能顯著優于現有臨床指標；更重要的是，通過蛋白質組“偽時間”分析，實現了對復發緩解型向繼發進展型多發性硬化轉化風險的預測，轉化時間與蛋白組分期呈顯著負相關。本研究不僅為MS的精準診斷和進展預測提供了強有力的新工具，更建立了從大規模發現到臨床轉化研究的完整范式，為神經免疫疾病的精準醫療開辟了新路徑。

構建了迄今最大規模的腦脊液蛋白質組數據庫（圖1）： 研究團隊依托慕尼黑工業大學神經生物樣本庫，收集了超過5000份高質量CSF樣本，涵蓋了多發性硬化、感染性疾病、神經退行性疾病等廣泛的神經系統疾病譜系。為實現這一大規模隊列的深度分析，團隊首先在實驗流程上實現了關鍵突破：通過整合Agilent Bravo自動化液體處理工作站，將樣品前處理通量從傳統手工操作的12樣本/天大幅提升至60樣本/天；后期引入Orbitrap Astral質譜儀后，通量進一步達到100樣本/天，為大規模隊列分析提供了技術保障。在質譜檢測層面，研究采用了雙平臺互補策略：timsTOF Pro 2平臺采用優化后的dia-PASEF模式，在21分鐘梯度內實現高效分離；Orbitrap Astral平臺則結合FAIMS接口和150個隔離窗口，在11.5分鐘內完成單樣本檢測，顯著縮短了分析時間。為獲得高覆蓋率的鑒定結果，譜圖庫的構建采用了實驗餾分與AlphaPeptDeep深度學習預測相結合的創新策略，并通過LOESS回歸對兩個平臺的離子庫進行合并優化，確保了數據的一致性和完整性。最終的數據產出顯示了優異的技術性能：timsTOF平臺平均每樣本鑒定約1500種蛋白質，而Astral平臺進一步提升至2100種，其中包含約150種蛋白亞型。在檢測穩定性方面，超過1000種蛋白在80%以上的樣本中可穩定檢出；約800種蛋白的全流程變異系數低于20%，Astral平臺更有1000種蛋白達到這一標準，表明數據的定量精度高、重復性好。主成分分析顯示，生物學效應是驅動樣本變異的第一主成分，證實數據質量足以支撐后續的生物學發現。

圖1. 研究設計及蛋白質組學數據集特征

揭示了腦脊液蛋白組的主要變異來源是血腦屏障功能障礙： 研究團隊通過多元線性回歸模型系統評估了診斷組、年齡、性別、QAlb（albumin ratio）等協變量對腦脊液蛋白質組變異的影響，并在timsTOF、Astral及獨立OLINK數據集中進行跨平臺驗證。結果顯示，血腦屏障功能障礙解釋的蛋白質組變異度是疾病本身的三倍，且這一趨勢在所有平臺中高度一致，確立QAlb為腦脊液蛋白質組學研究中必須校正的首要混雜因素。通過匹配的CSF與血漿蛋白質組數據對比，作者發現了其內在原因：CSF是血漿的超濾液，稀釋倍數高達約100倍，約70%的CSF蛋白與血漿重疊，且總蛋白濃度與QAlb呈極強正相關。這意味著，CSF中多數蛋白的濃度波動，主要取決于血腦屏障的通透性。若不校正QAlb，直接比較兩組患者的蛋白濃度，觀測到的差異可能僅僅是屏障功能差異的反映，而非真實的疾病病理變化。研究還特別指出，對質譜數據進行全蛋白組歸一化處理，會使非血漿來源的腦源性蛋白“顯得”降低，若未校正QAlb，同樣可能扭曲真實的生物學發現。針對這一混雜效應，研究團隊提出了三種實用的校正策略：（1）回歸校正：在統計模型中納入QAlb作為協變量，是校正混雜因素的金標準；（2）替代指標：使用ITIH1和C5這兩個蛋白作為QAlb的可靠替代指標，適用于QAlb數據缺失的情況；（3）選擇性歸一化：基于不受QAlb影響的特定蛋白子集進行歸一化。此外，研究還厘清了其他協變量的影響：年齡調控數百至上千種蛋白，部分效應與QAlb相關；而性別、紅細胞污染、白細胞計數則調控特定的蛋白集，且這些效應與疾病效應基本正交，在不同疾病中表現一致。

開發了22蛋白診斷組合： 為解決OCB陰性MS患者的鑒別診斷難題，研究團隊從5000余份樣本中選取約1600例分層子集（包括MS、其他炎性疾病和對照），按年齡、性別、QAlb、IgG比值、OCB狀態和白細胞計數進行匹配，并采用Orbitrap Astral平臺重新檢測獲得每樣本2100種蛋白的深度覆蓋數據。在此基礎上，通過XGBoost多分類模型結合嵌套交叉驗證和特征遞歸消除算法，初步篩選出30個候選特征蛋白。為實現臨床轉化，團隊進一步建立了靶向質譜檢測方法：基于變異系數和信噪比，從每個候選蛋白中優選出1條特征肽段，最終鎖定了一個包含22條肽段（代表22種蛋白）的精簡診斷組合。在獨立驗證隊列中，這一22蛋白組合展現出優異的診斷性能。在全樣本分析中，其診斷準確率與包含OCB狀態、IgG比值等指標的臨床常規模型相當。而在最具挑戰的OCB陰性患者亞組中，該蛋白組合的診斷效能顯著超越臨床常規模型。這一突破性結果為OCB陰性患者提供了客觀、精準的分子診斷依據。從生物學功能看，該組合中的22種蛋白廣泛覆蓋了MS的核心病理通路：髓鞘/軸突損傷（MBP、NEFM）、小膠質細胞/先天免疫（CHIT1、C1QB）、B細胞相關（JCHAIN、IGKC、TNFRSF17、FCRL5）、T細胞相關（CD7、CD27）、基質重塑（MMP9、SDC1），其中FCRL5和CTSW是既往研究中未受充分重視的蛋白，為理解MS免疫機制提供了新視角。此外，靶向方法的驗證數據顯示，該組合的生物效應差異是技術流程變異系數的5-15倍，且對樣本加載量的變化具有穩健性，表明其已具備在臨床實驗室落地的可行性，有望為MS的個體化診斷與分層提供新一代工具。

建立了基于蛋白質組的MS疾病分期體系： 研究團隊借鑒單細胞測序的“偽時間”概念，通過訓練一個區分MS患者與健康對照的XGBoost二分類模型，利用模型輸出的SHAP值，將所有樣本（包括患者和對照）排列成一個從健康到疾病的連續分子譜系。在這個譜系中，健康對照集中在早期，而MS患者分布在晚期；該“偽時間”與患者采樣時的殘疾評分顯著相關，且隨著偽時間推進，免疫球蛋白負荷及神經損傷標志物（如MBP、NEFM）的檢出率逐漸增加，證實了該分期體系捕捉到了疾病特異性病理變化。在針對不同疾病亞型的分析中，研究通過分層子集消除了年齡和白細胞計數的影響，發現：復發緩解型MS的標志物主要涉及適應性免疫，而進展型MS則更多富集先天免疫特征。值得注意的是，RRMS相關蛋白中檢測到了EB病毒蛋白EBNA1的人源互作蛋白，進展型MS（PMS）相關蛋白則富集補體系統和HLA-DRB1/5。通過滑動窗口分析對蛋白軌跡進行排序，最強的MS關聯蛋白包括MMP9、FCRL5和CTSW。其中，FCRL5作為非典型記憶B細胞標志物，提示B細胞耗竭治療需平衡感染風險。在臨床結局關聯分析中，該偽時間體系展現出強大的預測能力：不僅與采樣時及遠期（5-15年后）的殘疾評分顯著相關，最關鍵的是，后期由RRMS轉化為SPMS的患者，其在轉化前數年的基線偽時間已顯著高于未轉化者。從采樣到臨床確診轉化的中位時間為3年，且轉化時間與偽時間呈顯著負相關。本研究首次證明，利用橫斷面隊列的蛋白質組數據，即可構建能預測數年后果疾病進展風險的分子分期工具。這為MS的個體化治療決策，特別是針對新興的“進展獨立于復發活動”靶向治療的患者分層，提供了全新思路。

綜上所述，本研究在MS生物標志物領域取得了多項突破性進展，其核心優勢包含以下五個方面：（1）規模空前：基于5000余份腦脊液樣本、每樣本1500-2100種蛋白的深度覆蓋，為神經疾病蛋白質組學研究樹立了新標桿；（2）技術突破：通過自動化樣品前處理、高靈敏度質譜和深度學習譜圖庫預測，實現了高通量、深覆蓋、高穩健性的檢測流程；（3）系統解析：首次全面評估了血腦屏障功能障礙、年齡、性別等協變量對腦脊液蛋白組的影響，揭示了QAlb校正的必要性并提供替代方案；（4）臨床轉化：構建了從發現隊列→分層特征選擇→靶向方法開發→獨立驗證隊列驗證的完整鏈條，為其他標志物研究提供了可復制的范式；（5）預后價值：通過偽時間分析證實橫斷面隊列蛋白質組可預測長期殘疾進展和RRMS→SPMS轉化風險，為新興的進展靶向治療提供了患者分層工具。

本研究依舊存在一定的局限性。首先，質譜蛋白質組學提供相對定量而非絕對濃度，部分蛋白因樣本基質差異無法穩定檢出，本研究策略聚焦于檢出的關聯而非缺失信號。其次，臨床驗證具有遞進性，雖已轉化為靶向檢測方法并在獨立隊列中驗證，但真正的臨床認證仍需建立基于已知濃度標準品的絕對定量方法，并在多中心、前瞻性隊列中驗證臨床獲益，同時與MRI等影像學指標整合確定最佳應用場景。第三，診斷金標準存在局限性，依賴于長期臨床隨訪和專家判斷，難以獲得尸檢確認等終極金標準，研究團隊通過嚴謹的隊列設計、分層分析和多維度驗證，最大限度地挖掘了現有隊列價值。第四，OCB陰性MS樣本的稀缺性，因其自然發生率低導致驗證隊列中此類樣本有限，研究團隊通過將部分發現隊列樣本轉入驗證隊列的方式緩解了這一問題。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10143-0

制版人： 十一

參考文獻

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