生產(chǎn)優(yōu)化 + 佐劑升級(jí)，給貓狗更靠譜的保護(hù)

摘要；狂犬病作為致死率近 100% 的人畜共患病，至今仍無(wú)有效治療手段，疫苗接種是防控關(guān)鍵。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)團(tuán)隊(duì)研發(fā)的 SFV-RVG 病毒樣囊泡狂犬病疫苗，通過(guò)優(yōu)化生產(chǎn)工藝（確定最佳感染復(fù)數(shù)、細(xì)胞密度等參數(shù)），并篩選出高效佐劑，在小鼠和犬類模型中展現(xiàn)出卓越的免疫效果。研究發(fā)現(xiàn)，GEL02 佐劑搭配 SFV-RVG 疫苗，能誘導(dǎo)持續(xù)且高效的中和抗體反應(yīng)，保護(hù)力優(yōu)于商業(yè)疫苗，為狂犬病防控提供了新的候選方案，尤其對(duì)作為主要傳播源的犬類意義重大。

一、狂犬病有多可怕？現(xiàn)有疫苗的 “短板” 待補(bǔ)齊

提到狂犬病，大家的第一反應(yīng)都是 “致命”—— 這可不是夸張，一旦出現(xiàn)臨床癥狀，死亡率幾乎達(dá)到 100%，全球每年有超過(guò) 6 萬(wàn)人因此喪生，動(dòng)物感染后同樣難逃厄運(yùn)。這種疾病由狂犬病病毒（RABV）引起，病毒表面的糖蛋白（G 蛋白）是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵，而疫苗接種是目前預(yù)防狂犬病的唯一有效手段。

但現(xiàn)有疫苗存在不少 “痛點(diǎn)”：常規(guī)授權(quán)疫苗的免疫原性不足，需要多針接種才能達(dá)到足夠保護(hù)水平，不僅增加了免疫成本，還降低了接種依從性；而用于野生動(dòng)物的減毒活疫苗，雖然免疫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，卻存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，常用的氫氧化鋁佐劑也有局限，可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)減弱，還可能引發(fā)局部組織損傷、慢性炎癥等不良反應(yīng)。

更關(guān)鍵的是，狗狗是大多數(shù)狂犬病流行地區(qū)的主要傳播源，研發(fā)安全、高效的犬用狂犬病疫苗，是控制狂犬病傳播的核心環(huán)節(jié)。因此，科學(xué)界一直在尋找更優(yōu)的疫苗方案，而 “病毒樣囊泡（VLVs）” 技術(shù)的出現(xiàn)，為新型狂犬病疫苗的研發(fā)提供了新方向。

二、疫苗 “主角” 登場(chǎng)：SFV-RVG 病毒樣囊泡的優(yōu)勢(shì)

這次研究的核心疫苗候選者，是一種名為 SFV-RVG 的病毒樣囊泡疫苗。它可不是普通疫苗，而是結(jié)合了塞姆利基森林病毒（SFV）的復(fù)制酶和狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）的 “基因工程產(chǎn)物”。

病毒樣囊泡的最大優(yōu)勢(shì)在于 “安全且高效”：它能在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制，同時(shí)高效表達(dá)狂犬病病毒的關(guān)鍵抗原（G 蛋白），刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)；但它沒(méi)有完整的病毒基因組，不會(huì)引發(fā)感染，安全性大大提升。此前研究已經(jīng)證實(shí)，這種經(jīng)過(guò)改造的病毒樣囊泡，病毒滴度能達(dá)到 10^8 空斑形成單位 / 毫升，具備成為優(yōu)質(zhì)疫苗的潛力。

不過(guò)，要讓實(shí)驗(yàn)室里的 “潛力股” 變成能大規(guī)模應(yīng)用的疫苗，還需要解決生產(chǎn)工藝優(yōu)化的問(wèn)題 —— 畢竟，工業(yè)化生產(chǎn)需要穩(wěn)定的產(chǎn)量和一致的質(zhì)量。

三、生產(chǎn)工藝大優(yōu)化：從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)化的突破

為了讓 SFV-RVG 疫苗實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)關(guān)鍵生產(chǎn)參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括感染復(fù)數(shù)（MOI）、細(xì)胞密度和收獲時(shí)間三個(gè)核心指標(biāo)。

研究團(tuán)隊(duì)使用 BHK-21 細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的 “載體”，在不同規(guī)格的培養(yǎng)瓶和搖瓶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試了不同細(xì)胞密度（2×10^5、1×10^6、1.3×10^6 個(gè)細(xì)胞 / 毫升）和不同感染復(fù)數(shù)（0.01、0.03、0.05、0.1）對(duì)病毒產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論使用哪種培養(yǎng)容器，病毒滴度都在感染后 48 小時(shí)達(dá)到峰值，這說(shuō)明 48 小時(shí)是最佳收獲時(shí)間。

而在所有測(cè)試條件中，感染復(fù)數(shù) 0.03和細(xì)胞密度 1×10^6-1.3×10^6 個(gè)細(xì)胞 / 毫升的組合，能穩(wěn)定產(chǎn)出最高滴度的 SFV-RVG 疫苗（圖 1）。這個(gè)優(yōu)化結(jié)果在搖瓶懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中也得到了驗(yàn)證，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在 5 升自動(dòng)化灌注生物反應(yīng)器中進(jìn)行了規(guī)模化生產(chǎn)驗(yàn)證。通過(guò)控制培養(yǎng)溫度（37℃）、pH 值（7.0-7.2）、溶解氧（50% 空氣飽和度）等參數(shù)，并維持葡萄糖濃度在 1.40-3.61 克 / 升，確保細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)（密度 1.3×10^6 個(gè)細(xì)胞 / 毫升），按照優(yōu)化后的感染復(fù)數(shù)（0.03）接種病毒，最終成功實(shí)現(xiàn)了 SFV-RVG 疫苗的穩(wěn)定規(guī)模化生產(chǎn)（圖 2）。

疫苗生產(chǎn)后，還需要經(jīng)過(guò)濃縮和純化處理。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)膜過(guò)濾和柱層析技術(shù)，成功去除了疫苗中的雜蛋白，最終獲得了高純度的 SFV-RVG 疫苗。Western blot 檢測(cè)證實(shí)，純化后的疫苗能高效表達(dá)狂犬病病毒 G 蛋白，而透射電鏡觀察顯示，疫苗顆粒形態(tài)完整，大小在 52-132 納米之間（平均 98 納米），完全符合疫苗的質(zhì)量要求（圖 3）。

四、佐劑 “強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合”：11 種候選者中，這 2 種表現(xiàn)最佳

疫苗的免疫效果，除了抗原本身，還離不開佐劑的 “助力”—— 佐劑就像免疫反應(yīng)的 “催化劑”，能顯著增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。為了找到最適合 SFV-RVG 疫苗的佐劑，研究團(tuán)隊(duì)篩選了 11 種常用佐劑，包括氫氧化鋁、PolyI:C、M103、GEL02 等，在小鼠模型中進(jìn)行了全面評(píng)估。

研究團(tuán)隊(duì)給小鼠肌肉注射了不同佐劑搭配的 SFV-RVG 疫苗，然后在接種后 7、14、21、28、35、42 天采集血液，檢測(cè)中和抗體（VNAs）水平 —— 中和抗體是判斷狂犬病疫苗保護(hù)效果的關(guān)鍵指標(biāo)，能直接中和病毒，阻止感染。

結(jié)果令人驚喜：所有搭配佐劑的疫苗，免疫效果都優(yōu)于無(wú)佐劑的 SFV-RVG 疫苗，其中M103和GEL02兩種佐劑的表現(xiàn)最為突出（圖 4B）。具體來(lái)說(shuō)，M103 佐劑能快速誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，在接種后 14 天和 21 天就達(dá)到最高中和抗體滴度，適合需要快速產(chǎn)生保護(hù)力的場(chǎng)景；而 GEL02 佐劑的優(yōu)勢(shì)在于 “長(zhǎng)效持久”，從 28 天開始，中和抗體滴度一直保持最高，持續(xù)到 42 天仍維持在高水平。

進(jìn)一步的細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，M103 和 GEL02 都能顯著提高 IFN-γ 和 IL-4 的表達(dá)水平 ——IFN-γ 是 Th1 型免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫；IL-4 則主要介導(dǎo) Th2 型免疫反應(yīng)，促進(jìn)抗體產(chǎn)生。這說(shuō)明兩種佐劑都能誘導(dǎo)平衡的 Th1/Th2 免疫反應(yīng)，既保證了中和抗體的產(chǎn)生，又增強(qiáng)了細(xì)胞免疫的保護(hù)作用（圖 4C、D）。

更重要的是，和市售商業(yè)疫苗相比，M103 和 GEL02 搭配的 SFV-RVG 疫苗，在小鼠模型中表現(xiàn)更優(yōu)：不僅誘導(dǎo)的狂犬病病毒特異性 IgM、IgG、IgG1 等抗體水平更高（圖 4E-G），中和抗體滴度也更具優(yōu)勢(shì)，而且接種后小鼠沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床癥狀或體重變化，安全性和商業(yè)疫苗相當(dāng)（圖 4L）。

在致命性狂犬病病毒（CVS-24 株）攻擊實(shí)驗(yàn)中，無(wú)疫苗對(duì)照組的小鼠全部死亡，商業(yè)疫苗組的存活率為 60%，而 M103 和 GEL02 佐劑組的存活率均達(dá)到 80%，充分證明了這種新型疫苗的強(qiáng)大保護(hù)力。

五、犬類實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：GEL02 佐劑成為 “最終贏家”

由于狗狗是狂犬病傳播的核心載體，研究團(tuán)隊(duì)在犬類模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了最優(yōu)佐劑的效果。他們將 3 個(gè)月大的比格犬隨機(jī)分為 3 組，分別接種 M103 佐劑 SFV-RVG 疫苗、GEL02 佐劑 SFV-RVG 疫苗和商業(yè)疫苗，然后持續(xù)監(jiān)測(cè)免疫后的抗體反應(yīng)。

結(jié)果顯示，在犬類體內(nèi)，GEL02 佐劑的表現(xiàn)更為突出：從接種后 21 天開始，GEL02 佐劑組的中和抗體滴度顯著高于 M103 佐劑組和商業(yè)疫苗組，到 28 天時(shí)中和抗體水平超過(guò) 40 IU/mL（圖 5B），遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織推薦的有效保護(hù)閾值（0.5 IU/mL）。同時(shí)，GEL02 佐劑組誘導(dǎo)的 IgM、IgG、IgG1 和 IgG2 抗體水平，也都顯著高于其他兩組（圖 5C-F），證明其能在犬類體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈且持久的體液免疫反應(yīng)。

這一結(jié)果也說(shuō)明，佐劑的效果存在物種差異：M103 在小鼠體內(nèi)能快速誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，但在犬類體內(nèi)的表現(xiàn)不如 GEL02；而 GEL02 無(wú)論是在小鼠還是犬類中，都能保持高效的免疫增強(qiáng)作用，尤其適合作為犬用狂犬病疫苗的佐劑。

六、總結(jié)：新型疫苗的應(yīng)用前景與未來(lái)方向

這項(xiàng)研究通過(guò)生產(chǎn)工藝優(yōu)化和佐劑篩選，成功打造了一款性能卓越的新型狂犬病疫苗 ——SFV-RVG+GEL02 佐劑疫苗。它的優(yōu)勢(shì)十分顯著：

首先，生產(chǎn)工藝成熟可規(guī)模化，通過(guò)確定最佳感染復(fù)數(shù)、細(xì)胞密度和收獲時(shí)間，在生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定高產(chǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可行方案；

其次，免疫效果優(yōu)異，在犬類體內(nèi)能誘導(dǎo)持續(xù)且高水平的中和抗體，保護(hù)力優(yōu)于商業(yè)疫苗；

再者，安全性高，疫苗本身是病毒樣囊泡，無(wú)感染風(fēng)險(xiǎn)，接種后無(wú)明顯不良反應(yīng)；最后，佐劑選擇精準(zhǔn)，GEL02 佐劑能平衡 Th1/Th2 免疫反應(yīng)，兼顧體液免疫和細(xì)胞免疫。

對(duì)于狂犬病防控而言，這款疫苗的出現(xiàn)具有重要意義。尤其是針對(duì)作為主要傳播源的犬類，它能提供更高效、持久的保護(hù)，有望減少狂犬病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，為全球狂犬病防控貢獻(xiàn)力量。

當(dāng)然，研究也存在一些需要完善的地方，比如目前尚未在實(shí)際養(yǎng)殖場(chǎng)景中驗(yàn)證疫苗效果，犬類的細(xì)胞免疫反應(yīng)也未進(jìn)行直接檢測(cè)。未來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步優(yōu)化疫苗純化工藝，提高抗原回收率，并在真實(shí)養(yǎng)殖環(huán)境中開展臨床試驗(yàn)，同時(shí)深入研究佐劑發(fā)揮作用的分子機(jī)制，為疫苗的進(jìn)一步升級(jí)提供理論支持。

相信隨著技術(shù)的不斷完善，這款新型狂犬病疫苗有望早日投入應(yīng)用，為人類和動(dòng)物的健康保駕護(hù)航，讓 “談狂犬病色變” 的時(shí)代逐漸成為過(guò)去。

識(shí)別微信二維碼，添加生物制品圈小編，符合條件者即可加入

生物制品微信群！

請(qǐng)注明：姓名+研究方向！

本公眾號(hào)所有轉(zhuǎn)載文章系出于傳遞更多信息之目的，且明確注明來(lái)源和作者，不希望被轉(zhuǎn)載的媒體或個(gè)人可與我們聯(lián)系(cbplib@163.com)，我們將立即進(jìn)行刪除處理。所有文章僅代表作者觀不本站。