浙江大學ACS Nano：新型納米療法增強水凝膠為口腔組織修復提供協(xié)同抗菌與免疫調(diào)節(jié)新策略

口腔環(huán)境的濕潤、動態(tài)特性以及復雜的微生物和免疫挑戰(zhàn)，使得傳統(tǒng)水凝膠在治療口腔潰瘍、牙周炎等疾病時，常面臨生物粘附力不足、藥物釋放不可控、抗菌抗炎效果有限等瓶頸。口腔組織缺損極易受到多種病原體定植，引發(fā)過度炎癥和氧化應激，阻礙組織修復。因此，開發(fā)一種能緊密貼合不規(guī)則創(chuàng)面、具有動態(tài)力學適應性、并能持續(xù)釋放廣譜抗菌及免疫調(diào)節(jié)藥物的新一代水凝膠，成為口腔再生醫(yī)學領(lǐng)域的迫切需求。

為應對這一挑戰(zhàn)，浙江大學李曉東副研究員、羅巧潔副主任醫(yī)師和陸軍軍醫(yī)大學張建祥教授合作提出了一種納米療法增強的多功能水凝膠新策略。該研究首先通過靜電相互作用，將具有抗炎抗氧化功能的姜黃素（CUR）與抗菌聚合物聚氨丙基雙胍（PAPB）自組裝成雙生物活性納米顆粒（CP NPs），兩種藥物的負載量均超過40%。隨后，將CP NPs整合到由明膠甲基丙烯酰（GelMA）和氧化透明質(zhì)酸（OHA）構(gòu)成的光交聯(lián)雙網(wǎng)絡水凝膠中，構(gòu)建了名為GOCP的雜化水凝膠。該凝膠通過氫鍵、靜電力和希夫堿等多種動態(tài)相互作用形成強化網(wǎng)絡，表現(xiàn)出可編程的機械性能、強大的組織粘附力（約80 kPa），并能持續(xù)72小時以上協(xié)同遞送CUR和PAPB，發(fā)揮抗菌、抗生物膜和免疫調(diào)節(jié)功能。相關(guān)論文以“Dual-Functional Nanotherapy-Reinforced Hydrogel for Synergistic Antimicrobial and Immunomodulatory Oral Tissue Repair”為題，發(fā)表在ACS Nano上。

研究的核心設計理念與治療機制可通過示意圖1系統(tǒng)展示。該圖闡明了GOCP水凝膠的多重相互作用增強網(wǎng)絡設計原理、在細胞層面通過調(diào)節(jié)炎癥/氧化應激及促進巨噬細胞向M2表型極化的治療機制、通過破壞跨膜電位導致胞質(zhì)成分泄漏的抗菌機制，以及在口腔潰瘍和牙周炎治療中的應用場景。

示意圖1：用于有效治療多種口腔疾病的多重相互作用增強動態(tài)水凝膠示意圖。 (A) 具有多重鍵合增強網(wǎng)絡的GOCP水凝膠的設計原理。 (B) GOCP水凝膠在細胞層面的治療機制，涉及炎癥/氧化應激調(diào)節(jié)和巨噬細胞向M2表型極化。 (C) GOCP水凝膠的抗菌機制，通過破壞跨膜電位和細胞質(zhì)成分泄漏介導。 (D) GOCP水凝膠在治療口腔潰瘍和牙周炎中的應用。

為了驗證CP NPs本身的生物活性，研究團隊對其進行了詳盡的表征與功能評估（圖1）。CP NPs呈現(xiàn)均勻的球形形貌，粒徑約172.5納米。光譜分析證實了CUR與PAPB之間強烈的靜電相互作用。功能實驗表明，CP NPs能劑量依賴性地清除超氧陰離子、過氧化氫、次氯酸等多種活性氧，并有效減輕脂多糖（LPS）刺激的巨噬細胞死亡，顯著抑制白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等促炎因子的表達，展現(xiàn)了優(yōu)異的抗氧化和抗炎潛力。同時，CP NPs對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等多種病原體表現(xiàn)出顯著的抑菌和殺菌活性，并能有效抑制生物膜形成。

圖1：多功能CP NPs的合成與表征。 (A) CP NPs制備過程示意圖。 (B, C) CP NPs的尺寸分布圖(B)和ζ電位值(C)。 (D, E) CP NPs的TEM (D)和SEM (E)圖像。比例尺：500納米。 (F-H) CUR與PAPB之間相互作用的光譜表征。CUR、PAPB及CUR-PAPB的FT-IR (F)、1H NMR (G)譜圖以及XRD圖譜(H)。 (I-K) CP NPs對不同濃度?O2?(I)、H2O2 (J)和ClO?(K)的清除作用。 (L) CP NPs在不同劑量下對DPPH?自由基隨時間變化的清除能力。 (M, N) 不同處理下RAW264.7巨噬細胞的典型流式細胞術(shù)圖譜(M)和定量分析(N)。 (O-R) 不同處理后RAW264.7巨噬細胞分泌的IL-1β (O)、TNF-α (P)、MPO (Q)和MCP-1 (R)的表達水平。

在細胞機制層面，CP NPs在調(diào)節(jié)巨噬細胞功能上顯示出卓越效果（圖2）。它能顯著降低LPS引起的巨噬細胞內(nèi)活性氧積累，保護線粒體膜電位和完整性，抑制巨噬細胞的過度遷移，并成功將促炎的M1型巨噬細胞逆轉(zhuǎn)為抗炎、促修復的M2型。RNA測序分析進一步揭示了其作用機制（圖3），CP NPs主要通過調(diào)控腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路，抑制促炎反應，增強抗氧化防御，從而協(xié)調(diào)炎癥微環(huán)境。

圖2：CP NPs在RAW264.7巨噬細胞中的體外生物學評價。 (A, B) 通過DCFH-DA染色顯示的RAW264.7巨噬細胞內(nèi)ROS水平的熒光圖像(A)和定量熒光強度(B)。比例尺：20 μm。 (C, D) 通過Mito-Tracker Red染色評估的線粒體活性(C)及相應定量(D)。比例尺：低倍，20 μm；高倍，10 μm。 (E, F) 顯示不同處理后巨噬細胞遷移行為的光學顯微鏡圖像(E)和定量分析(F)。比例尺：80 μm。 (G, H) 顯示iNOS、CD206和CD68表達水平的熒光染色(G)和定量熒光強度(H)。比例尺：20 μm。

圖3：CP NPs在巨噬細胞中生物學活性的機制研究。 (A) UpSet圖顯示不同組間共同差異表達基因及其交叉關(guān)系。 (B-D) DEG亞簇分析揭示了三個DEG簇在四組中不同的表達模式。 (E) 熱圖展示了四組中共同DEGs的表達情況。 (F, G) DEGs的基因本體(GO) (F)和KEGG (G)富集分析。 (H) 顯示TNF-α和TGF-β表達水平的代表性Western blot條帶。β-肌動蛋白作為上樣對照。 (I, J) TGF-β (I)和TNF-α (J)水平的定量分析。 (K, L) 巨噬細胞中TGF-β (K)和TNF-α (L) mRNA水平的qRT-PCR定量。

接下來，研究聚焦于將CP NPs工程化整合到水凝膠中（圖4）。將CP NPs負載入GelMA/OHA基質(zhì)后，形成的GOCP水凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更為致密。水凝膠的溶脹和酶降解行為得到優(yōu)化，并實現(xiàn)了CUR和PAPB的持續(xù)、可控共釋放，避免了突釋現(xiàn)象。流變學和粘附測試表明，CP NPs的加入以濃度依賴的方式增強了水凝膠的儲能模量和組織粘附強度，其中GOCP4（CP NPs濃度為0.4 mg/mL）表現(xiàn)出最優(yōu)的綜合力學性能。

圖4：納米療法增強水凝膠的工程化與表征。 (A) 通過將CP NPs負載到GO水凝膠中制備光固化水凝膠的示意圖。 (B) SEM圖像展示了凍干GOCP水凝膠的斷面及其數(shù)碼照片。比例尺：100 μm。 (C) 含有不同濃度Cy5標記CP NPs的GOCP水凝膠的熒光圖像。比例尺：10 μm。 (D) 不同GOCP水凝膠的酶降解測試。 (E, F) 含有不同含量CP NPs的GOCP水凝膠中PAPB (E)和CUR (F)的體外釋放曲線。 (G, H) 不同GOCP水凝膠的流變行為(G)及定量分析(H)。G′，儲能模量；G″，損耗模量。 (I, J) 不同CP NPs含量的GOCP水凝膠的粘附強度-位移曲線(I)和平均剪切強度(J)。 (K-N) GO (K)、GOCP2 (L)、GOCP4 (M)和GOCP8 (N)的觸變性測試。

抗菌性能評估證實了GOCP水凝膠的實戰(zhàn)能力（圖5）。在與多種口腔常見致病菌（包括牙齦卟啉單胞菌）共培養(yǎng)時，GOCP水凝膠能劑量依賴性地減少細菌菌落形成，破壞細菌膜結(jié)構(gòu)，導致鉀離子和β-半乳糖苷酶泄漏，其抗菌效果與臨床常用漱口水成分氯己定相當。

圖5：GOCP水凝膠的劑量依賴性抗菌效果。 (A-E) 在不同GOCP水凝膠表面粘附的金黃色葡萄球菌(A， B)、大腸桿菌(C)、MRSA (D)和牙齦卟啉單胞菌(E)的代表性光學圖像及菌落形成單位定量分析。 (F) SEM圖像顯示了粘附在GOCP水凝膠表面的不同細菌菌株的形態(tài)。比例尺：2 μm。 (G-N) 在不同處理下，包括金黃色葡萄球菌(G，K)、大腸桿菌(H，L)、MRSA (I，M)和牙齦卟啉單胞菌(J，N)，釋放到培養(yǎng)基中的K+ (G-J)和β-半乳糖苷酶(K-N)的定量。

動物實驗全面驗證了GOCP水凝膠的治療效果。在皮膚全層感染傷口模型中（圖6），GOCP水凝膠（尤其是GOCP4）能有效抑制傷口處多種細菌定植，加速傷口閉合，降低促炎因子（TNF-α， IL-1β， IL-6）水平，同時提升抗炎修復因子TGF-β的表達，并促進膠原沉積和組織再生。在更貼近臨床的口腔潰瘍模型中（圖7），GOCP水凝膠同樣顯著加快了潰瘍愈合速度，減輕了局部炎癥反應，促進了血管生成和巨噬細胞向M2型極化。最終，在牙周炎大鼠模型中（圖8），局部注射GOCP水凝膠能有效保留于牙周袋內(nèi)，顯著抑制牙槽骨吸收，促進骨組織再生，并調(diào)節(jié)牙周組織的炎癥微環(huán)境。

圖6：GOCP水凝膠在背部穿孔缺損大鼠模型中的抗菌和抗炎效果。 (A) 不同水凝膠制劑處理后，從傷口組織獲得的金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸桿菌和MDRAB菌落照片。 (B-E) 金黃色葡萄球菌(B)、MRSA (C)、大腸桿菌(D)和MDRAB (E)的定量CFU計數(shù)。 (F) 用GO、GOCP2、GOCP4和GOCP8處理的大鼠傷口變化代表性圖像。傷口面積軌跡（稱為TWA）也已示出。 (G, H) 大鼠背部缺損傷口面積變化(G)和傷口平均直徑(H)的定量分析。 (I-L) 不同處理后大鼠傷口組織中TNF-α (I)、IL-1β (J)、IL-6 (K)和TGF-β (L)的表達水平。 (M) 第21天時不同組傷口組織切片的H&E或Masson染色。比例尺：1毫米。紅色虛線指皮膚穿孔器創(chuàng)建的缺損區(qū)域。

圖7：GOCP水凝膠通過免疫調(diào)節(jié)加速口腔潰瘍愈合。 (A) 顯示第1天至第9天潰瘍愈合過程的代表性數(shù)碼圖像。黃色虛線表示潰瘍區(qū)域。 (B-E) 不同組中TNF-α (B)、IL-1β (C)、IL-6 (D)和TGF-β (E)的蛋白水平。 (F) H&E或Masson染色的組織切片。比例尺：1毫米。 (G) 顯示VEGF、TNF-α和IL-10相對水平的代表性免疫組化圖像。比例尺：1毫米。 (H) 顯示iNOS或CD206（紅色）表達水平的代表性熒光圖像。細胞核用DAPI（藍色）復染，而總的RAW264.7巨噬細胞用CD68（綠色）染色。比例尺：1毫米。

圖8：GOCP水凝膠促進牙周組織再生。 (A) 不同組大鼠腭側(cè)及牙槽骨矢狀截面的典型Micro-CT圖像。紅色雙箭頭表示距離（稱為CEJ-ABC）。 (B-E) 骨體積(BV) (B)、骨體積分數(shù)(BV/TV) (C)、連接密度(Conn.D) (D)和CEJ-ABC距離(E)的定量分析。 (F-I) 不同處理后牙周組織中TNF-α (F)、IL-1β (G)、IL-6 (H)和TGF-β (I)的表達水平。 (J) 經(jīng)H&E、Masson或TRAP染色的牙周組織代表性組織學切片。黑色箭頭指示牙周袋，藍色箭頭表示炎癥細胞，紅色箭頭顯示破骨細胞，黃色虛線指骨骼。比例尺：1毫米。

綜上所述，這項研究成功開發(fā)了一種基于自組裝納米療法的多功能增強型水凝膠。該平臺通過納米顆粒與水凝膠基質(zhì)間的多重動態(tài)相互作用，巧妙地將強效濕態(tài)組織粘附、可調(diào)機械性能與抗菌、免疫調(diào)節(jié)藥物的持續(xù)協(xié)同遞送融為一體。在多種口腔疾病模型中，該水凝膠展現(xiàn)出構(gòu)建物理屏障、長效抵御微生物入侵、精準調(diào)控局部免疫微環(huán)境和加速組織再生的協(xié)同療效。這一策略不僅為治療復雜的口腔炎癥性疾病提供了創(chuàng)新解決方案，其設計理念和多功能特性也顯示出應用于其他潮濕動態(tài)環(huán)境下組織修復（如鼻黏膜感染、慢性傷口等）的巨大潛力，有望滿足重大的未滿足臨床需求。