Cell?|?誰會被感染？細胞狀態早已注定

撰文 |咸姐

自2020年SARS-CoV-2全球大流行以來，病毒“細胞嗜性”的形成機制——即為何病毒僅能感染特定類型的宿主細胞——再度成為前沿研究的核心。傳統上，這種嗜性被認為主要由宿主細胞是否表達病毒進入和復制所必需的分子機器（如SARS-CoV-2所需的ACE2受體）所決定。然而，即使在已被證實為“可感染”的細胞群體內部，感染也絕非均質化。以經典的人呼吸道上皮模型Calu-3細胞系為例，該細胞本身內源性表達ACE2及另一關鍵因子TMPRSS2，但在低感染復數（MOI）條件下，SARS-CoV-2對Calu-3細胞的感染是可變的，因為只有少數細胞被感染【1】，這精準模擬了體內初始感染時僅極少數細胞暴露于病毒顆粒的真實情景。這種高度異質性提示，決定單個細胞命運的，可能遠不止受體是否存在。雖然外在因素（如病毒分布的隨機性）可能部分導致此現象，但一個更具根本性的假說認為，細胞群體內部存在著迥異的“內在狀態”，其中某一特定狀態使得該細胞對病毒入侵具有極高的易感性【2】。然而，驗證這一假說面臨著一個嚴峻的技術挑戰：病毒成功入侵后，會迅速并廣泛地關閉宿主細胞的轉錄功能，致使感染后進行的任何轉錄組分析都只能揭示病毒擾動后的狀態，而無法追溯感染前決定細胞命運的關鍵內在特征【3】。因此，如何突破這一技術壁壘，在感染發生前便精準鎖定并描繪那些“注定被感染”的細胞，成為了揭示單細胞水平感染異質性根本機制的核心難題。

近日，來自美國賓夕法尼亞大學的Arjun Raj團隊在Cell上在線發表題為Single-cell susceptibility to viral infection is driven by variable cell states的文章，創新性地應用了一種名為“Rewind”的回顧性單細胞克隆追蹤技術，揭示了具有特定可變表達模式的內在細胞狀態會增加對病毒感染的易感性，并且這一規律適用于多種不同的病毒。

本研究旨在首要解決的問題是宿主基因表達的內在變異性是否會影響細胞被感染的可能性，因此需要回顧性地識別和分析在感染發生之前注定要被感染的細胞。為此，本文研究人員設計開發了“單細胞克隆追蹤（Rewind）”這一突破性技術，其精妙之處在于通過給細胞植入可遺傳的DNA條形碼并追蹤其譜系，能夠“回顧性”地將感染后的結果與感染前細胞的原始轉錄組狀態精準關聯，從而繞過了病毒感染會迅速劫持并擾亂宿主細胞轉錄的難題。

本文研究人員首先對Calu-3細胞進行條形碼標記，經過三代細胞分裂后將細胞群體分成兩組。對其中一組進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），以獲取感染前的細胞狀態快照；另一組則用SARS-CoV-2進行感染，利用單分子RNA熒光原位雜交（smFISH）技術結合熒光激活細胞分選（FACS），篩選出被感染和未被感染的細胞。隨后，對每個分選細胞群的DNA條形碼進行測序，并將其與感染前scRNA-seq數據中識別出的條形碼進行匹配。scRNA-seq測序結果顯示，Calu-3細胞系并非一個均質的群體，而是由多種具有不同轉錄特征的細胞狀態共同構成，其本身具有高度異質性。更重要的是，作為SARS-CoV-2關鍵受體的ACE2和TMPRSS2，其mRNA在單細胞水平上的可檢測表達量極低。通過將感染前細胞的轉錄組狀態與其后續是否被感染的命運進行關聯分析，研究發現那些注定會被感染的“啟動”細胞在感染前就表現出獨特的基因表達特征。這些細胞主要富集在兩個特定的細胞狀態中：一個是高表達視黃酸信號相關基因（特別是TIG1）的狀態，另一個是處于快速細胞周期的狀態。相比之下，具有活躍JAK/STAT信號通路和干擾素刺激基因表達的細胞則幾乎不會被感染。

為了驗證所鑒定基因的表達與感染易感性之間的關聯，研究人員進行了條形碼富集實驗，證實高表達TIG1或MMP7的細胞克隆在后續感染中確實被顯著富集。通過藥物（他扎羅汀）誘導TIG1表達，研究人員發現人為上調TIG1可直接導致病毒感染率升高，反之，細胞傳代導致的TIG1高表達（TIG1-high）狀態丟失則伴隨感染率下降。CRISPR-Cas9基因敲除實驗證明，敲除TIG1、AXL、TSPAN8、MUC20等特定宿主因子能有效降低SARS-CoV-2的感染水平，其效果與敲除已知受體ACE2相當。這些結果共同證實，TIG1-high狀態是驅動SARS-CoV-2感染易感性的關鍵內在特征，而該狀態所包含的多個宿主因子在功能上直接促進了病毒感染。值得一提的是，研究人員還發現，和病毒感染一樣，細胞在群體中所處的位置及其行為，很可能也是由細胞內在的、預先編程的狀態所決定的。進一步地研究結果表明，ACE2受體的表達只是感染的必要條件，但僅ACE2的表達不足以識別出對感染高度易感的細胞群，真正決定高度易感性的，是ACE2陽性細胞中一個特定的、由TIG1等標記定義的細胞狀態亞群。而這些與“啟動”狀態相關的宿主因子是通過特異性地促進SARS-CoV-2的病毒進入步驟來影響病毒感染的。 與此同時，利用偽時間軌跡分析，研究人員發現AXL、TSPAN8和TIG1等基因在調控細胞進入易感狀態中起重要作用，敲除上游因子AXL或TSPAN8不僅降低了TIG1和MUC20的表達，還減少了易感細胞的比例，表明這些基因通過調節細胞狀態來影響病毒感染的易感性。此外，敲除上游調控因子AXL或TSPAN8，會特異性地減少那些同時高表達ACE2蛋白和高表達TIG1 mRNA的細胞亞群，而對僅高表達ACE2卻低表達TIG1的細胞沒有影響。這一結果證明，這些因子并非全局性地影響ACE2的表達，而是通過精確控制ACE2陽性細胞中那個特定的、處于“啟動”狀態的亞群（即TIG1-high細胞）的數量，來調控群體水平的病毒感染率。

那么，TIG1-high狀態是否更容易在更接近模擬人類呼吸道的非癌模型系統中感染SARS-CoV-2呢？研究人員利用人誘導多能干細胞（iPSC）分化的肺泡II型細胞（iAT2）模型，發現在iAT2細胞中，TIG1的表達同樣具有高度異質性，且其高頻表達（TIG1-high）主要集中于分化成熟的SFTPC（肺泡II型細胞的標記物）-high細胞亞群中。更重要的是，通過在該模型中應用Rewind譜系追蹤技術進行驗證，發現來自TIG1-high/SFTPC-high細胞的條形碼在感染群體中被顯著富集。通過分析公共人類肺部scRNA-seq數據庫，證實TIG1-high細胞狀態確實存在于人體的肺上皮細胞中，尤其異質性地表達于纖毛細胞和俱樂部細胞（Club cell）——這兩種均是已知的SARS-CoV-2靶細胞。與體外識別的易感狀態類似，體內TIG1-high的纖毛細胞和俱樂部細胞也表現出獨特的分子特征，并且這些特征與Calu-3模型中的TIG1-high狀態存在顯著的基因重疊。與此同時，通過分析來自不同疾病狀態和健康個體的公共單細胞轉錄組數據，研究人員發現，TIG1-high這一易感細胞狀態在人群中的存在比例并非固定不變，而是會受到個體所患的特定肺部疾病（如特發性肺纖維化）以及環境暴露（如吸煙）等因素的影響而動態變化。

最后，研究人員通過比較SARS-CoV-2原始株（WA1）與奧密克戎BA.1變體，發現TIG1-high細胞對兩種變異株都表現出更高的易感性，但其對原始WA1株的感染富集程度顯著高于BA.1變體，而且在原始株感染中起關鍵作用的多個宿主因子，對BA.1變體感染的促進作用普遍減弱。由此表明，雖然內在的細胞狀態仍是決定不同變異株感染的關鍵因素，但病毒進化可能改變了其對特定宿主狀態的依賴程度。此外，運用相同的單細胞克隆追蹤技術，研究人員發現細胞對流感病毒的易感性同樣由內在因素決定，但其靶向的細胞狀態與SARS-CoV-2截然不同。流感病毒易感的細胞并非TIG1-high群體，而是一個獨特的、表達KRT8、KRT18和CD46等標志性基因的細胞狀態。這一關鍵發現證實，即使在同一種細胞群體內，不同的病毒也傾向于感染具有不同內在轉錄狀態的細胞亞群，表明單細胞水平的易感性既是病毒特異性的，也是細胞狀態特異性的。

綜上所述，本研究利用回顧性單細胞克隆追蹤技術，發現SARS-CoV-2傾向于感染表達TIG1等視黃酸通路基因的特定細胞狀態，而甲型流感病毒則靶向另一個表達KRT8/CD46的截然不同的狀態。這些易感狀態在真實人體肺部中存在，并在特定疾病和吸煙者中更為常見。研究結果揭示，即使在同類型細胞中，病毒感染也非隨機，而是由細胞內在的、異質性的基因表達狀態預先決定。因此，決定單個細胞命運的，不僅是病毒受體，更是其感染前就已存在的“細胞身份”。這為理解病毒感染機制、個體差異及抗病毒策略提供了全新的“細胞狀態”視角。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.10.021

制版人： 十一

參考文獻

1. Powell, J., and Straub, T. (2018). Advances and remaining challenges in the study of influenza and anthrax infection in lung cell culture.Challenges9, 2.

2. Russell, A.B., Trapnell, C., and Bloom, J.D. (2018). Extreme heterogeneity of influenza virus infection in single cells.eLife7, e32303.

3. Walker, A.P., and Fodor, E. (2019). Interplay between Influenza Virus and the Host RNA Polymerase II Transcriptional Machinery.Trends Microbiol.27, 398–407.

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