抗體親和力/親合力概念、改造策略、不同檢測方法特點及與PK/PD的關系

單抗源于體液免疫的生物學機制，已成為診斷和治療多種疾病的多樣化、快速增長的療法。2022年超250種抗體進入臨床研究，2024年全球銷售額前10的藥物中至少一半為抗體。抗體藥物研發的一個核心挑戰是，早期開發階段需深度表征抗體的生物學特性，如親和力，以選擇最適合臨床需求的候選抗體。

抗體由2個Fab（抗原結合域）和1個Fc（可結晶片段）組成。Fab含互補決定區（CDRs），通過非共價結合識別抗原。Fc結合Fc受體（FcγRs），觸發免疫效應（如ADCC/ADCP）。此外，還有一些新型設計，如雙抗、ADC、免疫細胞因子融合物等。不同IgG亞型對FcγR的親和力不同，影響效應功能。可通過一些策略進行改造，比如糖工程（如去巖藻糖基化）增強ADCC；序列或鉸鏈區工程調節Fc柔性或取向；通過抗原結合引發的變構效應，間接調控Fc受體結合。另外，靶點類型也具備一定的多樣性，既有可溶性抗原（細胞因子、激素），也有膜蛋白（受體、信號分子）。抗體可以通過阻斷配體-受體復合物發揮作用，也可以通過FcγR激活效應細胞（如NK細胞）清除靶細胞，又可模擬多價配體誘導受體聚集（如激活免疫信號）。抗體親和力并非越高越好，需綜合評估親和力與功能的關系。本文圍繞抗體親和力這一話題展開討論。

親和力（Affinity）和親合力（Avidity）

首先需要區分一個概念親和力（Affinity）和親合力（Avidity）。

親和力（Affinity）指抗體與抗原的“結合強度”，反映抗體與抗原之間的結合緊密程度，由結合速率（kon）與解離速率（koff）共同決定，單位為平衡解離常數（KD=koff/kon）。主要描述CDR與抗原表位之間的相互作用，作用強度依賴非共價作用力，如氫鍵、范德華力、靜電作用等。

親合力（Avidity）指抗體雙價結合帶來的“整體親和力”，由于天然抗體為雙價結構，可同時結合兩個抗原，這種協同效應稱為親合力（Avidity），可表現為表觀親和力增強。抗體兩個Fab臂結合鄰近表位（如細胞膜上重復抗原），需同時解離才能釋放抗體，顯著延長解離半衰期。對于膜抗原，抗體與細胞表面抗原結合后，局部抗體有效濃度升高，第二結合事件更易發生，依賴于細胞密度與抗原表達水平。

下表總結了兩個概念的區別。

調節抗體-抗原結合的策略

序列改造調節抗體親和力

可以利用體外篩選與人工親和力成熟技術平臺，如噬菌體/酵母/哺乳動物展示系統實現。大致流程是，先構建天然抗體文庫，后通過PCR隨機突變或定點突變生成突變庫，再通過多輪篩選逐步提升親和力。該技術的優勢是無動物實驗倫理問題，且可精確控制親和力范圍。

也可以利用體內親和力成熟技術路徑，如免疫動物（如表達人源抗體基因的轉基因小鼠）后，從記憶B細胞/漿細胞中篩選高親和力抗體。該技術的優勢是可生成天然構象、高親和力且臨床轉化潛力高的抗體。缺點是親和力調控精度低于體外方法。

隨著技術的發展，下一代測序（NGS）與AI/ML的協同應用在抗體親和力改造方面也有一定價值，并可能是未來發展的重要方向之一。NGS可大規模獲取抗體編碼核酸序列，若已有大量抗體序列及其結合數據，進行AI模型訓練，AI/ML可用于預測高親和力序列，設計突變位點以優化親和力，或從頭設計抗體（denovo design），僅基于靶點信息構建高親和力抗體。目前已經有一些數據庫和資源支持以上操作，如序列數據庫OAS（Observed Antibody Space）和PLAb Dab（Patent and Literature Antibody Database）；結構/親和力數據庫SKEMPI、CATH、HER2結合數據集等。不過，截至目前，尚未有經AI/ML設計的抗體進入臨床。

通過結構工程提升抗體靶點結合效率

除通過改造序列，“提高親和力”外，還可通過改造抗體結構（如雙特異、多特異、附加功能域）來增強結合效率。

雙特異性抗體（bsAbs）指一條抗體分子含兩個不同Fab，可同時識別兩個抗原或一個抗原上的兩個表位。作用模式分為cis和trans兩種。Cis結合的兩個靶標位于同一細胞。這類分子可以通過“雙抗原共表達”提高選擇性，減少對單陽性細胞的“on-target/off-tumor”毒性。需精細調節每個臂的親和力，若某臂親和力過高，可因單價結合而喪失雙價優勢。Trans結合指兩個靶標位于不同細胞。經典案例包括免疫細胞重定向（如TAA×CD3 T-cell engager，或TAA×CD16A NK-cell engager）。

有雙抗，自然有三特異性抗體（trispecifics）。多抗既可以靶向不同抗原，也可以結合同一抗原不同表位，如雙表位抗體（biparatopic Abs），比如對于ADC藥物，可以促進受體聚集、內化、溶酶體降解，提升ADC的毒素遞送效率。

提到表位（epitope），又分為“功能性表位”和“非功能性表位”。功能性表位被結合后可阻斷配體、招募免疫細胞、促進ADC內化等。非功能性表位屬于即使被高親和力抗體結合，也不產生治療收益。所以，高親和力≠高療效，應優先靶向關鍵功能殘基或最佳免疫取向的表位。

抗原-抗體相互作用檢測

抗體親和力的測量需根據靶點特性和結合復雜性選擇合適技術，避免因實驗設計不當而誤解靶點結合能力。常用技術分為兩類：固定配體類（如SPR、BLI）、活細胞結合類（如流式細胞術、KinExA）

表面等離子共振（SPR）

原理：將抗原或抗體固定在金屬芯片表面，實時檢測結合/解離導致的光學折射率變化，計算結合速率（Kon）與解離速率（Koff），得出KD值。

優點：高通量、無標記；可測動力學參數

局限性包括：1）生理相關性差：固定抗原可能喪失天然構象，無法模擬細胞膜環境；2）多價結合干擾：實驗設計需抑制avidity（如通過低密度固定）；3）緩沖條件與體內差異大（pH、離子強度等）；4）超慢解離難測：需長時間洗脫，KD通常僅能測至低皮摩爾級。

活細胞結合技術：流式細胞術

原理：用不同濃度熒光標記抗體結合表達靶抗原的細胞，通過熒光強度計算半數結合濃度（EC50）和最大結合（Bmax）。

優點：保留抗原天然構象和膜環境，適合模擬生理狀態；可檢測抗體二價結合導致的avidity效應（如EC50降低但Bmax減少）。

局限性包括：1）EC50≠KD：高抗原表達或avidity會扭曲EC50與真實親和力的關系；2）假陰性風險：抗原-抗體內吞或細胞表面抗原脫落會降低信號，需低溫或固定細胞緩解，但可能降低生理相關性；3）需與動力學技術（如Ligand Tracer）聯用以確認平衡狀態。

KinExA（動力學排阻法）

原理：KinExA是一種基于溶液的親和力測定技術，不固定任何分子，維持抗原抗體在天然狀態下的平衡。將不同濃度的抗原與恒定濃度的抗體孵育至平衡，然后將混合物通過包被抗原的微珠，在極短時間（<0.5秒）內捕獲游離抗體，再用熒光二抗檢測，從而推算出游離抗體濃度，計算KD值。

優點：1）生理相關性強：無需固定，保留抗原天然構象；2）適用范圍廣：可用于膜蛋白、完整細胞、未純化樣品；3）高靈敏度：可測至fM級別；

局限性包括：1）通量較低：一次只能測一個樣品；2）背景干擾：血清中內源性IgG可能產生非特異信號。

單細胞相互作用細胞術（scIC/RT-IC）

原理：將表達抗原的活細胞固定在微流控“籠”中，熒光標記抗體在流動中通過，實時監測抗體結合與解離，記錄保留時間和熒光強度，評估affinity與avidity。

優點：1）真實細胞環境：抗原處于天然膜狀態；2）可測avidity：適合二價或多價抗體；3）動態監測：可觀察親和力成熟后的變化。

缺點是技術門檻高，設備復雜，尚未普及。

功能藥理學實驗用于親和力測定

原理：當抗體作為拮抗劑阻斷受體-配體結合時，可通過劑量依賴性抑制曲線估算其親和力。

方法包括：1）Cheng-Prus off修正：適用于競爭性抑制，但需確認非“tight-binding”系統；2）Schild分析：更嚴謹，適用于高親和力抗體，可判斷是否真正為競爭性結合。

用于親和力測定的各種方法的范式、優點、缺點和檢測范圍如下表所示。

親和力與PK/PD的關系

靶點介導的藥物處置（TMDD）

在某些情況下，可溶性靶抗原的大小和功能會決定抗原/抗體復合物的消除速率，這一現象被稱為靶點介導的藥物處置（TMDD）。一個典型例子是靶向PCSK9的抗體，其整體動力學呈非線性，消除半衰期較短。通過改造CDR，使抗體在內涵體pH6.0時親和力降低，可讓抗體在內涵體中與靶抗原解離并被細胞釋放，從而改變PCSK9的藥代動力學特征。目前已有多種抗體通過“pH開關”機制設計改善PK。

膜結合靶標也可能出現TMDD：靶抗原可能自然內化，或在與抗體結合后被誘導內化。其對抗體的影響取決于全身抗原表達量與抗體劑量的比例，以及抗體-抗原復合物的內化速率。簡單來說，復合物內化會形成非線性清除途徑，其中清除速率與抗原表達量、內化速率、抗原/抗體親和力相關。這可能降低細胞膜上的靶標占有率，對于ADC類藥物可能是件好事，對于需要阻斷靶點通路或依賴ADCC發揮作用的抗體則不利。

抗體分布

抗體親和力會影響其組織分布及到達靶部位的有效性。例如，“結合位點屏障假說”（binding site barrier hypothesis）指出，高親和力抗體難以穿透實體腫瘤，因為它們會被困在腫瘤外層抗原密集區域。此觀點還認為高親和力抗體會呈現出不同的分布特征。

抗體與抗原的相互作用可用于改善治療性抗體的組織分布。一個顯著案例是“腦穿梭”（brain shuttling）技術，該技術能增強抗體對中樞神經系統的穿透性。其原理是通過基因工程讓抗體包含一個結合域，該結合域可與介導內源性配體轉胞吞作用的受體結合，其中轉鐵蛋白受體是最常用的靶點。此類策略可能顯著改善阿爾茨海默病等疾病的治療效果。

鉤狀效應（Hook effect）

“過度擁擠”（Overcrowding）或“自身抑制”（auto-inhibition）是多價、多功能分子的一種特性，可能導致“鉤狀效應”——即藥物濃度過高時療效反而下降，這在體外實驗中常用于蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）的研究。在高濃度下，分子會與任一靶標形成二元復合物，從而阻礙功能性活性三元復合物的后續形成。這一現象在抗體依賴的ADCC以及T細胞和NK細胞銜接子中也需加以考慮。這種雙相濃度-效應曲線的形態取決于抗原的親和力和表達量，因此適合通過基于數學模型的方法進行優化。

另外，雙抗對兩種可溶性靶標均為單價，且可假設其兩個臂的結合是相互獨立的。這意味著，在給定抗體劑量下，針對某一靶標的結合位點數量相較于其單特異性親本抗體減少一半。因此，雙抗的有效劑量應為其來源的兩種二價“親本”抗體中較高者的兩倍。