Fc效應功能“完全沉默”的理想突變

抗體或Fc融合蛋白“去效應功能化”的方法主要有兩種，包括：1）選擇與C1q及Fcγ受體親和力較低的亞類（IgG2或IgG4）；2）引入特定點突變。早期的“沉默”突變包括：N297突變（去除糖基化位點）或L234A/L235A（LALA突變）。

然而，這些突變并不能完全消除與Fcγ受體的結合，也難以完全避免臨床上不期望的炎癥反應。此后又發展出多種新的沉默突變，但由于各研究使用的檢測體系差異很大，缺乏系統比較，難以判斷哪種突變的效應功能沉默效果最好（most effective silencing）。有團隊構建了一套Fab相同、Fc區各異的IgG抗體庫，涵蓋國際非專利名稱（INN）數據庫及文獻報道的全部亞類與突變體，并系統比較了它們與人C1q的結合；與人、小鼠、食蟹猴Fcγ受體的結合；在細胞功能實驗中的活性。

結果也比較有意思，即便殘余親和力極低的分子，也可在細胞實驗中表現出顯著功能。迄今為止，臨床使用的所謂“沉默”設計幾乎沒有真正完全沉默的。

免疫球蛋白“效應功能減弱”突變體目錄

參照INN數據庫和IMGT?數據庫，共計發現77種不同突變體可以潛在減弱Fc效應功能，列表如下。其中有一些是用的比較多的“熱門”突變體，在INN列表中出現頻率最高的8種突變體包括：

IgG1 L234A/L235A；

IgG4 F234A/L235A；

IgG1 N297G;

IgG1 N297A;

IgG1 L234A/L235A/P329G;

IgG4 L235E;

IgG1 L234A/L235A/G237A；

IgG1 L234F/L235E/P331S。

利用表面等離子共振（SPR）檢測與Fcγ受體的結合

以CD20抗體作為模板序列。

野生型親和力概況：1）IgG1、IgG3：對所有檢測的FcγR均有顯著結合；2）IgG2：強結合人FcγRIIa-131H、猴FcγRIIa和FcγRIIb；對人FcγRIIa-131R及FcγRIIb結合弱；3）IgG4：強結合各物種FcγRI及FcγRIIa/FcγRIIb；引入S228P穩定突變后結合力幾乎不變；4）IgG2/IgG4雜交型：對人受體結合顯著下降，但對猴受體結合基本保留。

完全沉默的突變體：1）234S/235T/236R（STR）三突變：無論置于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，對所有受體均無可測結合；2）IgG1-E233Δ/L234Δ/L235Δ同樣完全無信號；3）在IgG2或IgG2/1背景下，F296A/N297Q（去糖基化）也實現完全沉默。

部分沉默的“熱門”突變體：在INN中出現≥7次的“熱門”突變（如LALA系列或N297X去糖基化）仍能與≥2個FcγR產生可測結合，提示它們并非真正“沉默”。

單點突變效果：235、238、265、267、273、297、299、322、328、329、330、331等單點突變不足以完全阻斷FcγR結合。

與FcγRIIIa(158V)結合方面，STR三突變及若干其他突變體無結合。“熱門”突變體中（≥7個INN），僅N297A/G（去糖基化）無結合。

C1q結合（ELISA）

僅野生型IgG3（A????）和IgG1（A????）呈陽性；其余所有突變體無可見結合。

Fc效應細胞功能（ADCC/ADCP）

采用Raji（CD20?B細胞）為靶細胞；Jurkat報告細胞經轉染后攜帶NFAT-驅動的熒光素酶基因，并表達不同人FcγR。利用Promega報告基因系統進行檢測。

結果顯示，野生型IgG3雖與受體結合高，但細胞活性遠低于IgG1。部分SPR結合微弱的突變體，在細胞實驗中顯示相對高活性。所有突變體對FcγRIIIa的SPR結合及Promega ADCC反應幾乎均為陰性。

另外，采用Svar雙熒光報告系統，對Jurkat表達FcγRIIIa-158V、Jurkat表達FcγRIIa-131H的ADCC、ADCP進行了檢測。

結果顯示，ADCP兩系統結果相關良好，但Svar相對信號略低。ADCC作用方面，Svar系統和Promega出現明顯差異，前者對多種突變體給出顯著信號。

關于“熱門”突變體（≥7個INN）的細胞活性：僅IgG1-L234A/L235A/P329G（LALAPG）在所有細胞實驗中為陰性；去糖基化N297G/N297A在FcγRI-介導ADCP中呈高活性；其余熱門突變體仍與≥2個受體有顯著ADCP。

共11種完全沉默的突變體（STR背景+4IgG1+2IgG2+2IgG4+1IgG2/1雜交）在所有ADCP/ADCC實驗中均為陰性。

補體依賴細胞毒（CDC）

野生型IgG1、IgG3顯示出高活性。IgG2、IgG4野生型及所有突變體均無活性。

IgG1中表現高CDC的突變：1）去糖基化（N297A/G/Q/S/H）；2）L234A/G237A、L234F/L235E/D265A、L235A/G237A；3）單點突變：L235E、D265A、D265S。

其余突變體CDC均被有效沉默。

ADCC、ADCP、CDC結果如下表所示。

差示掃描熒光法（DSF）測定熱穩定性

關鍵參數：Ton（起始熔解溫度）；Tm（第一熔解峰溫度）

質控與判定標準

野生型IgG1：Ton=63.1℃，Tm=73.2℃

顯著降低閾值：Ton<61.9℃；Tm<72.6℃

野生型比較：IgG2、IgG3、IgG4的Ton與Tm均顯著低于IgG1。

IgG1突變體（51個）：30個突變體的Ton和/或Tm顯著降低。

降低最顯著：去糖基化突變（N297X、T299A）。

其他明顯降低的突變：L234F、L235E、P238S、D265A、V273E、K322A、L328R、P329G。

穩定性增強：STR三突變（234S/235T/236R）在IgG1–IgG4四個亞類中均使Ton與Tm提高2–4℃

自1980年代初第一個治療性單抗OKT3進入臨床以來，由“非預期炎癥反應”引發的副作用始終是單抗療法的一大障礙。早期研究發現IgG4亞型在體內似乎“惰性”較高，因此在需要避免炎癥的場景中優先選用IgG4抗體。但后續工作揭示，由于FcγR家族成員眾多、且存在不同基因多態性，IgG4在多數情況下仍具有顯著生物學活性。TGN1412（IgG4抗-CD28）的災難性臨床事件就是典型例證。

為徹底“沉默”Fc功能，研究者陸續開發了多種Fc區突變體，最早出現的是N297A（無糖基化）和L234A/L235A（LALA）。這些突變體雖被廣泛應用，但并未實現完全沉默，于是又出現了很多新的突變體。

本項研究發現：1）IgG1在所有結合與細胞實驗中均為強陽性，作為參照；2）IgG2：FcγRI幾乎無活性；FcγRIIa強陽性；FcγRIIb/III弱或陰性；CDC極弱；3）IgG3：所有FcγR結合及CDC均強陽性；除Svar ADCC外，其余細胞實驗反應較弱；4）IgG4：FcγRI、FcγRIIa強陽性；CDC陰性；FcγRIII結合及ADCC普遍弱。

絕大多數“沉默”突變體對FcγRIII幾乎無結合或功能（SPR或ADCC細胞實驗）。

FcγRI與FcγRII的情況更復雜：多數突變體仍保留一定活性，有時甚至接近野生型。值得注意，SPR中僅顯示低親和力結合的突變體，在細胞實驗中可能因抗體與受體均固定在細胞膜上而表現出更高“功能親和力”。

部分突變體能區分FcγRII亞型：IgG1L234A/L235A/G237A與L234A/L235E/G237A對131H-FcγRIIa和FcγRIIb活性高，卻對131R-FcγRIIa無活性。

158V-FcγRIIIa的活性一如既往地高于158F等位基因。

“全綠”突變體推薦（見上圖），唯一在所有檢測中均表現“綠燈”的是4種STR系列：1）IgG1和IgG3：L234S/L235T/G236R；2）IgG2：V234S/A235T/Δ236R；3）IgG4：F234S/L235T/G236R。

其它接近“全沉默”且熱穩定性尚可的組合：1）E233P/L234A/L235A/G236Δ/P329A；2）E233P/L234V/G236Δ/S267K；3）L234A/L235A/P329S；4）L234A/L235A/D265S；5）L235G/G236R。