改造5個位點(diǎn)，讓H5血凝素更穩(wěn)定，疫苗保護(hù)力大幅提升

摘要：高致病性H5N1禽流感的2.3.4.4b分支近年傳播范圍持續(xù)擴(kuò)大，跨物種感染風(fēng)險攀升。我團(tuán)隊(duì)針對該毒株血凝素（HA）穩(wěn)定性差的問題，引入5個突變構(gòu)建出穩(wěn)定化H5-FMLMI。冷凍電鏡顯示突變通過形成疏水相互作用維持HA結(jié)構(gòu)，小鼠實(shí)驗(yàn)中，穩(wěn)定化HA無論以蛋白還是mRNA-LNP形式遞送，都能誘導(dǎo)更高滴度的血凝抑制和中和抗體，還能將抗體應(yīng)答聚焦到受體結(jié)合位點(diǎn)，mRNA-LNP疫苗更能實(shí)現(xiàn)對H5N1攻擊的完全保護(hù)，為禽流感大流行防控疫苗研發(fā)提供了新方向。

一、H5N1的威脅，藏在不穩(wěn)定的HA里

高致病性H5N1禽流感從1996年開始大規(guī)模傳播，2021年2.3.4.4b分支成為全球優(yōu)勢毒株，2024年更是在美國造成奶牛和家禽的大規(guī)模疫情，還出現(xiàn)了人類感染病例。這類毒株能感染海獅、狐貍等多種哺乳動物，跨物種傳播的能力讓人警惕。更關(guān)鍵的是，H5N1的HA蛋白比季節(jié)性流感的更不穩(wěn)定，膜融合的pH值更高，現(xiàn)有滅活疫苗的免疫原性也偏弱，這成了疫苗研發(fā)的一大卡點(diǎn)。其實(shí)之前也有研究找到過HA穩(wěn)定化突變，但這些突變在體內(nèi)對免疫原性的影響，一直沒被徹底摸清。

圖1 穩(wěn)定化突變提升H5的熱穩(wěn)定性并減少內(nèi)部定向單克隆抗體的結(jié)合

二、5個突變，給H5 HA裝上“穩(wěn)定器”

我們從過往研究中篩選突變組合，最終在HA2結(jié)構(gòu)域引入H355F/K380M/R397M/L418I/E432L5個突變，命名為H5-FMLMI。用納米差示掃描量熱法檢測，pH8.0時H5-FMLMI-foldon的解鏈溫度達(dá)77.8℃，而野生型只有55.6℃，低pH下的穩(wěn)定性也大幅提升。蛋白純化后發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定化突變讓HA三聚體的閉合性更好，能顯著降低識別開放三聚體的FluA-20抗體結(jié)合，說明三聚體構(gòu)象更穩(wěn)定了。

三、冷凍電鏡揭秘：穩(wěn)定化的核心是疏水相互作用

為了弄清楚突變的作用機(jī)制，我們解析了H5-FMLMI-foldon的3.2?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。對比野生型HA，兩者的莖區(qū)和受體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的結(jié)構(gòu)偏差極小，這意味著突變沒破壞關(guān)鍵的抗原表位。仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，5個突變能在HA內(nèi)部形成新的疏水相互作用，比如R397M用疏水作用替代了原本的極性相互作用，H355F則把pH依賴的離子作用換成了疏水接觸，這些相互作用就像“粘膠”，把HA的結(jié)構(gòu)牢牢固定住。

圖2 冷凍電鏡顯示穩(wěn)定化突變通過形成疏水相互作用穩(wěn)定H5-FMLMI-foldon

四、小鼠實(shí)驗(yàn)：穩(wěn)定化HA的免疫應(yīng)答全面升級

我們在BALB/c小鼠中測試了穩(wěn)定化HA的蛋白疫苗和mRNA-LNP疫苗，免疫方案為0周初免、4周加強(qiáng)。初免后2周，穩(wěn)定化納米顆粒和膜錨定HA組的TX24結(jié)合滴度，就顯著高于未穩(wěn)定化的對照組。加強(qiáng)后6周，mRNA-LNP遞送的穩(wěn)定化納米顆粒，誘導(dǎo)的血凝抑制（HAI）滴度是所有組別中最高的，中和抗體滴度也同步提升，就連對異源株IN05，也能誘導(dǎo)更多有功能的中和抗體。

圖3 穩(wěn)定化H5疫苗在小鼠中誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗體應(yīng)答

五、抗體應(yīng)答的“重定向”：從非中和位點(diǎn)到RBS

用負(fù)染電鏡多克隆表位作圖（ns-EMPEM）分析抗體結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)所有組別中HA的E位點(diǎn)都是免疫優(yōu)勢位點(diǎn)，但未穩(wěn)定化HA誘導(dǎo)的抗體，很多靶向三聚體界面的內(nèi)部表位，甚至?xí)Y(jié)合單體HA。而穩(wěn)定化HA能顯著減少這類非中和抗體，讓更多抗體靶向受體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）。深度突變掃描（DMS）也證實(shí)，穩(wěn)定化HA誘導(dǎo)的中和抗體，主要靶向RBS附近的A、B表位，這也是中和活性提升的關(guān)鍵原因。

圖4 ns-EMPEM顯示穩(wěn)定化突變推動抗體應(yīng)答靶向RBS

圖5 DMS證實(shí)穩(wěn)定化HA誘導(dǎo)的中和抗體主要靶向RBS

六、mRNA-LNP疫苗：穩(wěn)定化HA實(shí)現(xiàn)完全保護(hù)

我們用5倍TCID50的TX24株H5N1攻擊免疫后的小鼠，觀察14天的體重變化和存活率。未穩(wěn)定化的納米顆粒組有1只小鼠死亡，平均體重下降7.2%，而穩(wěn)定化納米顆粒組和膜錨定HA組（無論是否穩(wěn)定化），小鼠體重?zé)o明顯下降，實(shí)現(xiàn)了100%的存活率。空LNP對照組的小鼠則全部死于感染，這個結(jié)果和之前的HAI、中和抗體數(shù)據(jù)完全吻合，證明穩(wěn)定化HA能轉(zhuǎn)化為實(shí)際的體內(nèi)保護(hù)力。

圖6 穩(wěn)定化H5 mRNA-LNP疫苗保護(hù)小鼠抵御H5N1攻擊

七、不止是穩(wěn)定，這些細(xì)節(jié)值得琢磨

坦白講，這次的實(shí)驗(yàn)也讓我發(fā)現(xiàn)了不少有意思的點(diǎn)。mRNA-LNP遞送的疫苗，免疫原性整體不輸甚至優(yōu)于蛋白疫苗，尤其是穩(wěn)定化納米顆粒的HAI滴度，比蛋白形式高了不少。另外，RC_I_1納米顆粒支架本身穩(wěn)定性偏弱，但穩(wěn)定化HA能彌補(bǔ)這個缺陷，讓疫苗仍有良好效果，要是換個更優(yōu)的支架，效果可能會更好。不過小鼠的免疫應(yīng)答和人類還是有差異，比如B細(xì)胞受體庫不同，后續(xù)還需要在更接近人類的模型中驗(yàn)證。

八、給禽流感疫苗研發(fā)的一點(diǎn)啟發(fā)

這次的研究證實(shí)，給H5 HA加上穩(wěn)定化突變，是提升疫苗效果的有效策略。這5個突變能在不同疫苗形式（蛋白、mRNA-LNP）、不同構(gòu)建體（foldon三聚體、納米顆粒、膜錨定）中發(fā)揮作用，說明這種穩(wěn)定化策略有通用性。而且mRNA-LNP疫苗兼具快速制備和高免疫原性的特點(diǎn)，結(jié)合穩(wěn)定化HA后，很適合作為大流行防控的候選疫苗。其實(shí)這類穩(wěn)定化突變也能嘗試用于其他甲型流感的HA，說不定能成為流感疫苗研發(fā)的通用技巧。

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