人源肝類器官實現 100% 成功率，這篇 Nature 怎么做到的

首次建立了人源成年肝細胞類器官（h-HepOrgs）的長期擴增體系，這篇 Nature 論文能教你搞定類器官的相關實驗設計[1]。

實驗設計的完美閉環

今天分析的這篇文章，主要是想帶大家看看頂刊團隊是如何從細胞來源突破到多細胞組裝、從功能驗證到疾病建模，形成一個完美的閉環。

• 文章亮點：首次建立了人源成年肝細胞類器官（h-HepOrgs）的長期擴增體系，并將其與膽管細胞類器官、門靜脈間質細胞組裝成「人源門靜脈肝組裝體」，用于模擬肝臟疾病和藥物篩選。
  

• 設計思路：細胞來源突破 → 長期擴增驗證 → 功能表征 → 多細胞組裝 → 疾病建模 → 治療應用。

• 適用領域：類器官、肝病建模、再生醫學。

• 發文思路：「類器官+多細胞組裝」。這篇文章的核心亮點不是單純「造了個肝細胞類器官」，而是將三種細胞類型組裝在一起，形成了「肝細胞+膽管細胞+間質」的復合結構，一下子就把模型的生理相關性提升到了新的高度，一下子就做出了新意。

具體實驗思路

1、先解決核心挑戰：人源成年肝細胞類器官在體外難以長期擴增：

解決方案：優先找到促進肝細胞擴增的條件：研究人員分析了人肝癌類器官和小鼠肝部分切除術后再生肝組織的轉錄組數據，通過 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）發現 YAP 和 WNT 信號通路在肝細胞增殖中被激活。基于這一發現，他們在原有培養基中添加了 WNT 激動劑（Wnt Surrogate）和 LATS1/2 抑制劑（TRULI）以激活 YAP 信號，成功實現了 h-HepOrgs 的長期傳代（>3 個月，>10 代，每周 1:2 傳代）。

更進一步地優化：去除煙酰胺（nicotinamide）可使類器官形成效率提高近 10 倍，最終確立了 h-HepOrg 擴增培養基 EM2（MM + WntS + TRULI - Nic）。利用這一體系，研究團隊從 28 例患者中 100% 成功建立了 h-HepOrgs，并創建了活體生物庫。

2、利用全面的分子表征證明 h-HepOrgs「像真的肝細胞」：

• RNA 測序：比較 h-HepOrgs 與原代人肝細胞（PHHs）的基因表達譜，發現高度相關，而膽管細胞類器官（h-CholOrgs）則單獨聚類

• 基因集富集分析（GSEA）：h-HepOrgs 富集了增殖相關基因特征，類似肝部分切除后的再生肝組織

• 免疫熒光：h-HepOrgs 表達 Ki-67 增殖標志物，且 YAP 定位于細胞核（證實通路激活）

• 核型分析：長期培養后染色體數目保持穩定

• 凍存復蘇：h-HepOrgs 可凍存復蘇而不喪失擴增能力

這些結果表明，h-HepOrgs 保留了原代肝細胞的特征，同時獲得了穩定的擴增能力。

3、通過功能實驗驗證 h-HepOrgs 保留肝細胞關鍵功能：

• 膽汁小管結構：透射電鏡觀察顯示，h-HepOrgs 形成了類似體內肝組織的膽汁小管結構（細長管腔）

• 白蛋白分泌：ELISA 檢測證實 h-HepOrgs 分泌白蛋白

• 藥物代謝酶活性：檢測 CYP450 酶活性，證實 h-HepOrgs 保留了藥物代謝功能

• 移植治療：將 h-HepOrgs 移植到肝病小鼠模型中，可恢復肝功能和肝小葉結構，證明其體內功能潛力

4、開始做「核心技術創新」：通過多細胞組裝構建人源門靜脈肝組裝體

研究團隊將 h-HepOrgs（肝細胞類器官）、h-CholOrgs（膽管細胞類器官，來自同一患者）、人源門靜脈間質細胞（原代分離，通過 CD90+PDGFRα+分選富集）三種細胞按特定比例混合培養后，細胞自組裝形成了門靜脈肝組裝體（periportal liver assembloids）。這一結構再現了體內門靜脈區域的細胞排布：膽管細胞和間質細胞被包裹在肝細胞實質中，形成了類似體內肝臟門靜脈區域的組織學結構。

再通過免疫熒光染色顯示，組裝體中肝細胞標志物（HNF4α、白蛋白）、膽管細胞標志物（CK7、CK19）和間質細胞標志物（α-SMA、vimentin）呈特征性分布。

5、通過空間轉錄組學驗證組裝體再現體內基因表達模式

為了證明組裝體「像真的門靜脈區域」，研究團隊進行了單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）分析。結果顯示：

• 組裝體中肝細胞、膽管細胞和間質細胞的基因表達譜與體內相應細胞高度一致

• 組裝體中肝細胞富集了脂肪酸代謝、補體、藥物代謝等經典肝細胞功能基因

• 門靜脈區域特征基因（如 SAA1、SAA2、APOA1）在組裝體肝細胞中表達

• 細胞間相互作用相關基因在組裝體中被正確激活

這些結果證實，組裝體在細胞組成、空間排布和基因表達三個維度上都高度模擬了體內門靜脈區域。

6、通過增加間質細胞數量，用組裝體模型模擬膽道纖維化

研究團隊進一步將組裝體用于疾病建模 —— 膽道纖維化。他們通過將門靜脈間質細胞數量增加 20 倍（從 25 個增加到 500 個），同時保持其他細胞數量不變，構建了「纖維化樣組裝體」：

• 膠原沉積和基質相關基因表達顯著增加

• 膽管細胞數量增加，呈現增殖表型（Ki-67 陽性）

• 肝細胞數量減少，伴隨凋亡增加

• 炎癥相關基因（TNF 信號、IL-4/IL-6、NF-κB、JAK-STAT）在肝細胞中富集

• TGF-β 信號通路在肝細胞和膽管細胞中均被激活

• 部分肝細胞表達膽管細胞標志物 KRT19，提示可能的轉分化

這些表型與臨床膽道纖維化患者（如原發性硬化性膽管炎、原發性膽汁性膽管炎）的轉錄組特征高度一致，為藥物篩選提供了「類器官層面」的疾病模型。

主要結果

1、成功建立了可長期擴增的人源成年肝細胞類器官（h-HepOrgs）

從 28 例患者中 100% 成功建立 h-HepOrgs，可長期傳代 >3 個月（>10 代），建立了活體生物庫。關鍵突破在于：通過激活 YAP 和 WNT 信號通路，突破了人源成年肝細胞體外擴增的技術瓶頸。

2、h-HepOrgs 保留了原代肝細胞的分子特征和功能

RNA-seq 顯示 h-HepOrgs 與原代肝細胞的基因表達譜高度相關，保留了膽汁小管結構、白蛋白分泌和藥物代謝功能。移植實驗證實其在體內可重建肝功能。

3、成功構建了人源門靜脈肝組裝體，再現體內組織排布

通過將 h-HepOrgs、h-CholOrgs 和門靜脈間質細胞共培養，構建了包含三種細胞類型的復雜組裝體，再現了體內門靜脈區域的組織學排布和細胞互作。

4、組裝體可用于模擬膽道纖維化和藥物篩選

增加門靜脈間質細胞數量可誘導組裝體發生纖維化反應，表現為膠原沉積、膽管細胞增殖、肝細胞凋亡和炎癥反應。這些表型與臨床膽道纖維化患者高度一致，為抗纖維化藥物篩選提供了新平臺。

5、患者來源的組裝體保留了供體特異性特征

不同患者來源的 h-HepOrgs 和組裝體保留了供體特異性的基因表達譜，包括與肝臟疾病易感性相關的基因（如肝炎病毒感染的 IL1RL1 和 ERAP2、肝癌的 GPC3 等），為個性化疾病建模和藥物篩選提供了可能。

小編點評

這篇文章最值得借鑒的是它的實驗設計邏輯：

第一，不是單純「造了個肝細胞類器官」，而是系統解決了人源成年肝細胞體外擴增這一難題。通過轉錄組數據驅動發現 YAP+WNT 激活方案，這種「組學引導」的策略值得借鑒。

第二，通過 RNA-seq、免疫熒光、電鏡、移植實驗多維度證明類器官，這種多模態驗證是頂刊的標配，也是說服審稿人的關鍵。

第三，不是滿足于單一細胞類型，而是將三種細胞類型組裝成復合結構，再現了體內門靜脈區域的細胞排布和互作。從「單細胞類器官」到「多細胞組裝體」，是類器官領域的重要發展方向。

第四，不僅構建了健康狀態的模型，還通過增加間質細胞數量誘導纖維化表型，實現了從「生理模型」到「病理模型」的跨越。這種「模型構建 → 疾病建模」的閉環，大大提升了研究的轉化價值。

第五，移植實驗證實 h-HepOrgs 可在體內重建肝功能，這是再生醫學應用的直接證據，為肝衰竭患者的細胞治療提供了新思路。

第六，從類器官培養技術，到多組學分析，到基因編輯，到活體移植，到疾病建模，每個技術都服務于回答問題，不是為了用技術而用技術。

對于時間有限或不熟悉多組學分析的研究者，這套「多細胞組裝+多組學驗證+多模態表征」的設計范式值得反復推敲。它將類器官研究從「單細胞模型」推向「多細胞互作系統」，從「生理觀察」升級為「疾病模擬」，讓模型的生理相關性和臨床轉化價值提升到了新的高度。

[1]. Yuan L, Dawka S, Kim Y, et al. Human assembloids recapitulate periportal liver tissue in vitro. Nature. 2026;650(8101):438-449. doi:10.1038/s41586-025-09884-1