患者治療后肝衰竭，醫生在她肝臟里找到了不該存在的“沉睡病毒”......

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突破性發現：AAV相關肝炎患者肝內檢出斷裂基因組！

撰文：安一

基因治療曾被視為罕見病的救命稻草，尤其是腺相關病毒（AAV）載體，憑借其安全性和高效性，已成功用于脊髓性肌萎縮癥（SMA）、血友病等多種疾病的治療。截至2025年，美國FDA已批準7款AAV基因療法，更多療法仍在臨床試驗中。

但光鮮背后，肝毒性始終是懸在AAV基因治療頭上的“達摩克利斯之劍”——靜脈輸注后，肝細胞損傷極為常見，部分患者甚至出現暴發性肝衰竭，不得不依賴大劑量激素治療。盡管這一問題已困擾臨床多年，但其背后的深層機制卻一直模糊不清。

近日，發表在《Nature Medicine》上的一項病例研究[1]，通過先進的宏基因組測序技術，首次在肝損傷患者的肝臟組織中發現了制造工藝殘留的質粒序列、斷裂重組的載體基因組，以及潛在的輔助病毒感染，為破解AAV相關肝毒性的謎題提供了關鍵線索。

病例聚焦：7歲脊髓性肌萎縮女孩的治療困境

研究團隊聚焦于一名7歲女性脊髓性肌萎縮1型（SMA 1）型患者，該患者攜帶SMN1基因7號外顯子純合缺失，僅保留2個SMN2拷貝。由于體重超過20kg，她接受了高劑量的onasemnogene abeparvovec（OA，一款獲批用于SMA治療的AAV9載體基因療法），總劑量達2.2×101?載體基因組（vg）。

治療后不久，患者就出現了明顯的肝炎癥狀：嘔吐、黃疸、腹痛伴尿色加深。實驗室檢查顯示，血清肝損傷標志物在輸注后7周達到峰值，其中丙氨酸轉氨酶（ALT）升至1236 U/L，γ-谷氨酰轉移酶（GGT）362 U/L，總膽紅素137 μmol/L，提示嚴重的肝細胞損傷和膽汁淤積。

臨床團隊隨即采用激素聯合他克莫司進行治療，他克莫司在7個月后成功停藥，但激素治療持續了19個月才逐步減量。為明確肝損傷的根本原因，醫生在患者肝損傷峰值時進行了肝穿刺活檢，并開展了全面的基因組學分析。

測序揭秘：肝臟中藏著“制造殘留”質粒

研究團隊對患者肝臟組織樣本進行了短讀長和長讀長宏基因組測序，同時結合原位雜交技術，意外發現了三類本不該出現在患者體內的不速之客——OA制造過程中使用的三種質粒序列。

OA的生產需要依賴三種關鍵質粒（圖1）：pSMN（攜帶治療性SMN基因）、pAAV2/9（提供AAV2復制基因rep和AAV9衣殼基因cap）、pHelper（提供腺病毒輔助復制基因）。理論上，經過嚴格的生產純化，最終輸注給患者的應只有包裹著SMN基因的AAV9病毒顆粒，質粒片段應被完全去除。

但測序結果顯示，患者肝臟中不僅存在完整的OA載體基因組，還檢測到了pSMN的質粒骨架、pAAV2/9的全長序列，以及部分pHelper片段。原位雜交驗證進一步證實，5.1%的肝細胞中存在三種質粒共有的細菌復制起點序列，5.8%的肝細胞中檢測到pAAV2/9特有的AAV9衣殼基因序列，而SMN基因的陽性細胞比例達28.5%（對照組僅0.4%-1.5%），明確了這些質粒序列并非測序污染，而是真實存在患者肝臟中。

圖1 制備OA所用質粒的示意圖及其作用機制

更值得關注的是，這些質粒序列并非完整存在，而是以片段形式與載體基因組相互融合，形成了復雜的重組產物。研究人員推測，這些質粒殘留可能是生產過程中“反向包裝”或純化不徹底導致的，而它們在體內與載體基因組的重組，可能觸發了異常的免疫反應或直接損傷肝細胞。

基因組亂象：斷裂、串聯與跨界融合

除了質粒污染，測序還揭示了載體基因組在患者肝臟中的混亂狀態。正常情況下，AAV載體進入肝細胞后，會以單鏈DNA形式釋放，隨后形成雙鏈DNA，并組裝成環狀游離體進行基因表達。但該患者的載體基因組卻出現了三大異常（圖2）：

1

廣泛斷裂與串聯化

載體基因組發生了大量斷裂，同時通過“頭對頭”“頭對尾”等方式串聯形成多聚體，這種結構與AAV復制過程中的滾環擴增特征相似。部分串聯后的DNA長度超過15 kb，遠超AAV載體5 kb的最大包裝容量，說明這些結構不可能是生產過程中包裝進去的，而是在患者體內形成的。

2

質粒-載體-人類基因組重組

長讀長測序發現，許多重組片段同時包含質粒序列（如pAAV2/9的rep/cap基因、pHelper的腺病毒基因）、載體基因組和人類基因組序列，形成了復雜的“三方融合體”。短讀長測序進一步證實，載體基因組與人類基因組之間存在大量融合連接點，分布在多個基因內部，但未發現明顯的整合熱點區域。

3

內部重排與異常轉錄

載體基因組自身也發生了頻繁的內部重排，主要集中在反向末端重復序列（ITR）區域，同時檢測到非經典剪接融合產物。不過幸運的是，這些異常重排的DNA大多沒有產生穩定的轉錄本，未形成大量異常蛋白。

圖2 肝活檢結果

a. 患者肝活檢可見顯著的門周炎癥、小葉炎癥及界面性炎癥，同時存在大量伴氣球樣變性的肝細胞。

b. 圖a 框選區域的高倍鏡視野，可見氣球樣變肝細胞的胞質呈明顯腫脹表現。

c. 圖 a 中標記區域的放大視野。

d. 圖 a 中標記區域的放大視野

e~g. 采用免疫組織化學（IHC）染色檢測 CD20（e）、CD8（f）及 CD4（g）的表達，顯示肝臟組織內的炎癥浸潤情況。

h. 腺病毒免疫染色結果為陰性。

研究人員分析，這些復雜結構的形成可能與質粒殘留中的rep基因、腺病毒輔助基因表達有關——這些基因可能激活了載體基因組的異常復制，進而導致斷裂、串聯和重組；也可能是ITR序列驅動的分子間重組所致。

意外發現：HHV-6B感染的潛在角色

在基因組分析中，研究團隊還意外檢測到了人類β皰疹病毒6B（HHV-6B）的完整基因組，PCR驗證顯示其循環閾值（CT）為26.2，提示患者存在HHV-6B感染，但未檢測到該病毒的RNA轉錄本，說明此時病毒處于潛伏狀態。

HHV-6B之所以值得關注，是因為它可能作為“輔助病毒”促進AAV的復制。此前研究發現，HHV-6家族病毒能提供AAV復制所需的關鍵因子，而在野生型AAV2相關的兒童肝炎患者肝臟中，也常能檢測到HHV-6感染。

不過，由于這是單病例研究，目前尚無法確定HHV-6B感染是肝損傷的直接原因，還是通過促進AAV載體異常復制間接加重損傷，這一關聯仍需更多病例驗證。

臨床啟示：基因治療的安全邊界在哪？

這項研究雖然僅聚焦于一名患者，但揭示的現象為理解AAV相關肝毒性提供了全新視角，也給臨床實踐和療法開發帶來了重要啟示：

1

肝毒性機制可能是“多重打擊”

以往認為，AAV肝毒性主要與衣殼蛋白引發的免疫反應有關，但本研究提示，制造殘留的質粒序列、異常重組的載體基因組、潛在的輔助病毒感染可能共同構成“多重打擊”，觸發肝細胞損傷或免疫激活。尤其是質粒中的細菌序列（如復制起點、抗生素抗性基因），可能通過TLR9通路激活先天免疫，這與此前發現的“載體外DNA引發免疫反應”的結論一致。

2

生產工藝需要更嚴格的質控

目前，即使遵循良好生產規范（GMP），AAV制劑中仍可能殘留少量質粒片段、空衣殼等雜質。研究結果提示，這些“微量雜質”可能具有顯著的生物學效應，未來需要優化純化工藝，進一步降低質粒殘留和異常重組產物的含量，同時加強對制劑中雜質的檢測和定量。

3

臨床監測需關注“基因組異常”

對于接受高劑量AAV基因治療的患者，尤其是體重較大的年長患者（本研究患者肝毒性更嚴重，與此前觀察到的“高劑量、高體重患者風險更高”一致），除了常規監測肝酶，未來可能需要開發無創檢測方法，監測體內質粒殘留和載體基因組重組情況，提前預警肝損傷風險。

4

仍需更多研究驗證因果關系

需要強調的是，這是一項單病例研究，仍有諸多問題待解答：質粒殘留和異常基因組結構在無肝損傷的AAV治療患者中是否存在？HHV-6B感染與肝損傷的關聯是否具有普遍性？這些異常結構是導致肝損傷的直接原因，還是損傷后的結果？

未來，需要開展更大規模的隊列研究，對比肝損傷與無肝損傷患者的肝臟組織樣本，明確這些異常現象與肝毒性的因果關系，同時探索如何通過優化載體設計、生產工藝和聯合用藥，降低肝損傷風險。

參考文獻：

[1]Buddle S, Brown LK, Morfopoulou S, et al. Contaminating plasmid sequences and disrupted vector genomes in the liver following adeno-associated virus gene therapy. Nat Med. 2026 Jan 16.

責任編輯：葉子

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