EBF：全血穩(wěn)定性研究在生物樣品分析方法學(xué)驗(yàn)證中的建議更新（2025）

采用血漿/血清開展生物樣品分析方法學(xué)穩(wěn)定性測(cè)試非常常見。不過，在生物樣品離心之前，樣本采集時(shí)的基質(zhì)（全血）本質(zhì)上與血漿/血清是不同的。也就是，血漿/血清只能代表離心后樣本，不能說明從人體/動(dòng)物采集的血液在運(yùn)輸、離心等前期環(huán)節(jié)中的穩(wěn)定性情況。

歐洲生物分析論壇（EBF）2008年進(jìn)行過一項(xiàng)調(diào)研，只有少數(shù)公司在常規(guī)進(jìn)行小分子的方法驗(yàn)證或方法開發(fā)時(shí)會(huì)包括全血穩(wěn)定性，而對(duì)于大分子，幾乎沒有任何公司開展。據(jù)EBF成員反饋，與血漿/血清穩(wěn)定性數(shù)據(jù)相矛盾的全血穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的發(fā)生率很低。言外之意，待測(cè)藥物在血漿/血清中穩(wěn)定，在全血中應(yīng)該也是穩(wěn)定的。然而，其實(shí)自2001年以來，F(xiàn)DA關(guān)于生物分析方法驗(yàn)證的監(jiān)管指導(dǎo)（Guidance for Industry-Bioanalytical Method Validation）就指出“穩(wěn)定性程序應(yīng)評(píng)估在樣本采集和處理過程中分析物的穩(wěn)定性”。EMA在相關(guān)指南（Draft Guideline on Validation of Bioanalytical Methods）中也提到“應(yīng)充分關(guān)注采血后樣本基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性”。

中國(guó)藥典2020版《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中指出，應(yīng)特別關(guān)注受試者采血時(shí)，以及在儲(chǔ)存前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性，以確保由分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時(shí)刻的分析物濃度。ICH M10也建議進(jìn)行全血穩(wěn)定性測(cè)試，即樣品從受試者采集之后到儲(chǔ)存之前，應(yīng)該充分關(guān)注樣品基質(zhì)（全血）中待測(cè)物的穩(wěn)定性。

開展全血穩(wěn)定性的挑戰(zhàn)之一，許多生物分析專家認(rèn)為血漿穩(wěn)定性是血液穩(wěn)定性的可接受替代品，例外情況非常罕見，僅限于某些已知的化合物類別，如N-氧化物或羥肟酸。不過，有證據(jù)表明血漿穩(wěn)定性可能不是血液穩(wěn)定性的良好指標(biāo)。血液和血漿穩(wěn)定性不匹配的情況占5%左右。挑戰(zhàn)之二來自新鮮空白血液的可用性問題。另外，分析物在血細(xì)胞和血漿之間達(dá)到分布平衡的時(shí)間未知。還有一點(diǎn)，是否應(yīng)像處理血漿/血清數(shù)據(jù)那樣對(duì)全血分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，或者是否需要額外的準(zhǔn)確度和精密度數(shù)據(jù)來證明在全血中進(jìn)行的測(cè)量與在血漿中進(jìn)行的測(cè)量同樣可靠。

自2008年以來，EBF內(nèi)部進(jìn)行了密集的討論，努力對(duì)作為血漿/血清方法開發(fā)和驗(yàn)證一部分的藥物全血穩(wěn)定性測(cè)試的時(shí)機(jī)、流程、問題等達(dá)成一致。從時(shí)間角度，最初只有少數(shù)公司參與這些實(shí)驗(yàn)，但隨著時(shí)間的推移，EBF成員公司逐漸增加了對(duì)血液穩(wěn)定性的常規(guī)測(cè)試。從科學(xué)角度而言，確保樣本中的分析物濃度從采集點(diǎn)到生成血漿/血清基質(zhì)的樣品過程中得以保持，全血穩(wěn)定性評(píng)估至關(guān)重要。

EBF在2011年首次發(fā)布了關(guān)于全血穩(wěn)定性測(cè)試的建議，并在2025年做了進(jìn)一步更新，以下是具體介紹。

關(guān)于新鮮血液的供應(yīng)：盡管生物分析人員在確保新鮮血液供應(yīng)方面存在困難，但EBF內(nèi)部調(diào)查顯示，對(duì)于許多公司來說，這似乎并不是一個(gè)主要障礙。然而，關(guān)于“新鮮”血液的定義以及在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)血液應(yīng)該有多新鮮是一個(gè)核心問題。2011年，EBF絕大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，如果在采集后的24小時(shí)內(nèi)使用，并且使用與血漿分析中相同的抗凝劑，則血液可以被視為新鮮的。當(dāng)然，血液不應(yīng)被冷凍。即使在冷藏或冰上保存，也不應(yīng)超過建議的時(shí)間。建議在添加樣品前將血液預(yù)熱至37℃，以模擬生理?xiàng)l件。不過，2011年這版建議對(duì)于EBF社區(qū)的許多成員來說執(zhí)行起來極為困難，尤其是對(duì)于臨床前血液，因?yàn)檫@些血液需要購(gòu)買并運(yùn)輸?shù)缴锓治霈F(xiàn)場(chǎng)。此外，對(duì)于24小時(shí)的時(shí)間限制也沒有科學(xué)依據(jù)。2025年更新后的建議是，如果血液在采集后5天內(nèi)冷藏并使用，則可以被視為新鮮的。

實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)：2011年，EBF許多專家建議向血液中添加測(cè)試化合物（體外添加）的血液樣本進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，然后將這些樣本離心以收集血漿，進(jìn)而使用現(xiàn)有的經(jīng)過驗(yàn)證的血漿分析方法來分析這些血漿樣本。當(dāng)然，如前文所述，在將測(cè)試化合物添加到血液中時(shí)，血液應(yīng)被加熱至37℃。分析全血穩(wěn)定性樣本的實(shí)驗(yàn)過程可能是通過添加乙腈或類似溶劑來沉淀蛋白質(zhì)，這些溶劑最好含有內(nèi)標(biāo)。在收集了所有穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)的樣本后，可以測(cè)量上清液，并將結(jié)果與零時(shí)間點(diǎn)獲得的參考值進(jìn)行比較。2025年，更新后的建議是在全血中比較穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)與零時(shí)間點(diǎn)的峰面積比。

體外平衡時(shí)間的確定：盡管平衡通常很快，但并非瞬間完成。在EBF內(nèi)部討論中，認(rèn)為有些化合物需要孵化15分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到平衡。雖然這樣的例子可能很罕見，但應(yīng)明確強(qiáng)調(diào)，作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一部分，建議估計(jì)必要的孵化時(shí)間。

濃度水平、重復(fù)次數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于存在爭(zhēng)議的其他主題，如測(cè)試多少濃度水平、進(jìn)行多少重復(fù)以及生成的數(shù)據(jù)的接受標(biāo)準(zhǔn)是什么。EBF認(rèn)為，血液穩(wěn)定性測(cè)試的接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與血漿穩(wěn)定性測(cè)試中應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)相同。

種屬：2011年，EBF建議全血穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將首先在一個(gè)種屬中進(jìn)行，只有在觀察到不穩(wěn)定性時(shí)，才會(huì)擴(kuò)展到其他種屬。2025年EBF更新后的建議是，全血穩(wěn)定性測(cè)試可以在人血中進(jìn)行，并且只有在人血中觀察到不穩(wěn)定性，或者在臨床前血漿中觀察到不穩(wěn)定性的情況下，才擴(kuò)展到臨床前全血。這種方法在很大程度上克服了行業(yè)在獲取新鮮臨床前血液方面的挑戰(zhàn)，并考慮了3R原則，即只有在絕對(duì)必要時(shí)才使用臨床前全血。EBF經(jīng)驗(yàn)表明，人類全血穩(wěn)定性數(shù)據(jù)在監(jiān)管申報(bào)中是可以接受的，以支持臨床前數(shù)據(jù)。

當(dāng)然，全血穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)小分子分析用的色譜法。對(duì)于生物藥常用的配體結(jié)合方法不適用。

引自：2025, Whole blood stability in bioanalytical method validation: updated recommendations from the European Bioanalysis Forum；2011, Blood Stability Testing: European Bioanalysis Forum View on Current Challenges for Regulated Bioanalysis

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