在花園的堆肥里，我學(xué)到了博士生涯中的最重要一課

在德國(guó)小鎮(zhèn)普倫的一處花園里，一桶堆肥成了一位新博士生研究的起點(diǎn)。從最初的偶然發(fā)現(xiàn)，到對(duì)機(jī)制的執(zhí)著追問(wèn)，他很快便直面自然體系的高度復(fù)雜性，對(duì)實(shí)驗(yàn)證明無(wú)從下手。通過(guò)調(diào)整思路、反復(fù)實(shí)驗(yàn)，他最終迎來(lái)了屬于自己的 Eureka 時(shí)刻。在看似繁瑣而枯燥的實(shí)驗(yàn)中積累經(jīng)驗(yàn)，他也學(xué)會(huì)了如何與研究中的“黑箱”相處。這不僅是一項(xiàng)研究的完成，更是一段科研方法與心態(tài)的歷練——在平凡的研究中，學(xué)生得以成長(zhǎng)。

撰文 | 趙彥淞（Max Planck Institute for Evolutionary Biology）

2021年8月底，我來(lái)到德國(guó)北部群湖環(huán)繞的小鎮(zhèn)普倫（Pl?n），在那里的馬克斯·普朗克進(jìn)化生物學(xué)研究所（Max Planck Institute for Evolutionary Biology）開始博士研究，課題是復(fù)雜微生物群落里的水平基因轉(zhuǎn)移（即DNA片段在不同的微生物個(gè)體之間的交換）。我的導(dǎo)師Paul Rainey是一位功成名就的進(jìn)化生物學(xué)家，當(dāng)時(shí)的研究興趣已逐步轉(zhuǎn)向到從哲學(xué)層面解釋和應(yīng)用進(jìn)化理論（如個(gè)體性的進(jìn)化轉(zhuǎn)變、人類和人工智能的共進(jìn)化等），但仍始終保持著生物學(xué)家從經(jīng)驗(yàn)主義的實(shí)驗(yàn)中歸納推理的思路，研究水平基因轉(zhuǎn)移便是希望借此理解微生物群落在功能層面的進(jìn)化規(guī)律。

實(shí)施這些實(shí)驗(yàn)必然要選擇一個(gè)“模式群落”，恰好，Paul對(duì)回歸田園情有獨(dú)鐘，在房子附近開墾了很大一片花園，定期把枯枝爛葉撿到一個(gè)大垃圾桶里做堆肥，于是我們就決定研究這個(gè)堆肥里的微生物群落。那年9月底的一個(gè)陽(yáng)光明媚的周日，我第一次到Paul的院子里采集堆肥樣品，從此開始了對(duì)這個(gè)堆肥數(shù)以年計(jì)的探索。

簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)

在讀博起初的一年里，我們把這個(gè)堆肥當(dāng)作一個(gè)整體來(lái)研究，在實(shí)驗(yàn)室不同條件下養(yǎng)堆肥群落，進(jìn)行測(cè)序和生信分析。在幾年前，Paul為了追蹤不同群落之間的基因轉(zhuǎn)移，設(shè)計(jì)并實(shí)施過(guò)一個(gè)大型的實(shí)驗(yàn)：收集不同來(lái)源的堆肥樣品，分別培養(yǎng)形成獨(dú)立的群落，然后定期交換它們的濾液（濾液里沒有細(xì)菌或真菌，但可能有病毒和質(zhì)粒等），每次交換后再對(duì)其進(jìn)行宏基因組測(cè)序。這樣一來(lái)，如果某個(gè)群落里突然出現(xiàn)了一段新序列，而這段序列恰好能從之前時(shí)間點(diǎn)的其他群落中找到，那么這段序列很可能就是通過(guò)濾液在群落間發(fā)生了轉(zhuǎn)移。我按照設(shè)計(jì)實(shí)施了實(shí)驗(yàn)，但初步結(jié)果并不理想——出現(xiàn)了太多假陽(yáng)性序列，大部分應(yīng)該是由于宏基因組測(cè)序深度不足所致。而這些堆肥群落本身極為復(fù)雜，我的生信分析水平也非常有限，一時(shí)間項(xiàng)目推進(jìn)舉步維艱。

意識(shí)到這種大型實(shí)驗(yàn)太野心勃勃，我開始思考如何簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)。原方案本質(zhì)上是追蹤不同群落之間的基因交換，那要是去研究一個(gè)群落和某個(gè)特定菌株的基因交換，豈不是等于減少掉了一個(gè)維度？

恰好，我們實(shí)驗(yàn)室在過(guò)去幾十年來(lái)建立起的模式菌株——假單胞熒光桿菌SBW25——起初就是從植物根系中分離的，理論上可以適應(yīng)花園堆肥環(huán)境。于是，我就在實(shí)驗(yàn)室里對(duì)SBW25菌進(jìn)行連續(xù)傳代，并在每次傳代時(shí)向培養(yǎng)液里加一些堆肥濾液。得到十幾代之后，我將菌液鋪板，挑取單菌落，再對(duì)這些菌落重新進(jìn)行測(cè)序，看它們有沒有從濾液中獲取新的基因片段。

在此，我必須感謝Paul答應(yīng)了我測(cè)序的請(qǐng)求。后來(lái)我得知，他當(dāng)時(shí)覺得這基本是天方夜譚，“當(dāng)我們開始用花園堆肥進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，我以為我們可能永遠(yuǎn)也找不到任何新基因片段。堆肥太復(fù)雜了，細(xì)菌捕獲這些片段的概率太低了。”但無(wú)論如何，他出資讓我測(cè)了幾十個(gè)菌落，幾周后拿回原始數(shù)據(jù)，分析時(shí)我也并未抱太大希望。出乎我們所有人意料的是，在其中一個(gè)菌落中，真的組裝出了一段55 kb的陌生序列（我們把它叫作I55）！這個(gè)意外之喜是我博士階段最核心的發(fā)現(xiàn)，但我當(dāng)時(shí)遠(yuǎn)未意識(shí)到它的意義。不然的話，我也不會(huì)只依稀記得這發(fā)生在2022年11月底，而說(shuō)不清具體是哪一天了。

探尋機(jī)制

我所在的實(shí)驗(yàn)室名為“微生物種群生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室”，主要關(guān)注種群動(dòng)態(tài)及其成因，所以發(fā)現(xiàn)I55后，自然而然提出的第一個(gè)問(wèn)題就是：為什么它會(huì)以足夠的頻率被小范圍抽樣捕獲到？有兩個(gè)可能的假設(shè)。首先說(shuō)第一種：I55極大提升了宿主細(xì)菌的存活和繁殖能力，也就是被自然選擇青睞，從而在連續(xù)傳代中占比不斷上升。要驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，需要做適應(yīng)度實(shí)驗(yàn)，即比較不同細(xì)菌在同一環(huán)境中的擴(kuò)增能力，而這正是我們實(shí)驗(yàn)室的看家本領(lǐng)。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行適應(yīng)度實(shí)驗(yàn)，我們很快就肯定了假設(shè)的正確性。后續(xù)通過(guò)噬菌體分離和連續(xù)敲除實(shí)驗(yàn)，我們確認(rèn)了I55在堆肥濾液里的高適應(yīng)度是源于其序列上的二型限制-修飾系統(tǒng)對(duì)濾液中一個(gè)烈性噬菌體的抗性。我們對(duì)鎖定有效基因這一步投入了比較大的精力（感謝幫助我的技術(shù)員Christina Vasileiou），但從本質(zhì)上說(shuō)，這一步屬于經(jīng)典的還原論方式，而最終鎖定的有效系統(tǒng)也早已被研究得非常透徹。從探索潛力上講，這個(gè)發(fā)現(xiàn)略為平凡，但這就是清晰的事實(shí)——it is what it is。

我個(gè)人更感興趣的其實(shí)是第二種假設(shè)，且這個(gè)假設(shè)是與第一種并行不悖的。在上述機(jī)制中，I55隨著宿主細(xì)菌的繁殖而復(fù)制，但它或許還能自主復(fù)制，并在不同細(xì)菌間擴(kuò)散傳播？要檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)，本質(zhì)上是測(cè)試I55能否在不同SBW25菌株之間移動(dòng)。為此，我們?cè)贗55上插入了一段抗生素抗性標(biāo)簽，并將其與野生型菌混合，看標(biāo)簽?zāi)芊窨缂?xì)胞轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是我們最期待的版本——I55確實(shí)能在細(xì)菌間傳播，但當(dāng)且僅當(dāng)環(huán)境中存在堆肥濾液時(shí)。這個(gè)結(jié)果其實(shí)已經(jīng)回答了種群動(dòng)態(tài)方面的問(wèn)題，即它為何能在傳代中迅速擴(kuò)散。不過(guò)，出于最自然的好奇心，還有一個(gè)問(wèn)題不容忽視：這段序列的轉(zhuǎn)移機(jī)制是什么？

通過(guò)一系列針對(duì)性實(shí)驗(yàn)，我們基本排除了共軛（即通過(guò)細(xì)菌間的物理連接傳遞DNA片段）和轉(zhuǎn)化（即細(xì)菌從環(huán)境中吸收游離的DNA片段）的可能性，一切證據(jù)都暗示I55的移動(dòng)是依賴濾液中某些成分的協(xié)助，極有可能是某些噬菌體。此前驗(yàn)證第一個(gè)假設(shè)時(shí)，我們已從濾液里分離出了很多噬菌體株，現(xiàn)在需要逐一嘗試它們能否導(dǎo)致I55的轉(zhuǎn)移。然而令人沮喪的是，結(jié)果都是陰性的。

盡管沒能搞清楚轉(zhuǎn)移機(jī)制，但群體層面的兩個(gè)假設(shè)都得到了驗(yàn)證，加之重復(fù)進(jìn)行的捕獲實(shí)驗(yàn)以及生信分析（與同所的馬越博士合作）都發(fā)現(xiàn)了很多類似I55的序列，我們此時(shí)就覺得故事已經(jīng)完整，便將這些發(fā)現(xiàn)寫成了論文。我的導(dǎo)師對(duì)商業(yè)性學(xué)術(shù)出版社的高收費(fèi)和剝削行為很反感，因此近年來(lái)的工作只投給非營(yíng)利性的學(xué)會(huì)期刊，又因?yàn)槲覀冏哉J(rèn)為這項(xiàng)工作尚未闡明分子機(jī)制，顯然達(dá)不到《科學(xué)》（Science）期刊的標(biāo)準(zhǔn)，于是就把手稿投給了《美國(guó)科學(xué)院院刊》（PNAS）。論文送審后被拒，審稿意見在意料之中——鎖定協(xié)助I55轉(zhuǎn)移的介質(zhì)將極大提升工作深度。但這究竟是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)——易于從堆肥中分離出的噬菌體都證明不能協(xié)助轉(zhuǎn)移，那么還能從何處著手搜尋有效介質(zhì)呢？悲觀地想，I55的轉(zhuǎn)移或許依賴的是無(wú)法分離的噬菌體，甚至可能不僅依賴一種噬菌體，而是幾種噬菌體加特定小分子物質(zhì)……自然可以如此復(fù)雜，復(fù)雜到我們窮盡一生都無(wú)法驗(yàn)證所有的排列組合。

從還原到整體——Eureka時(shí)刻

但凡事都有兩面，既然我們無(wú)法改變自然的復(fù)雜，何不接受它，并把這種復(fù)雜化為己用？之前的思路都是先從濾液中純化成分，再檢驗(yàn)其有效性，這種自下而上的窮舉，終究敵不過(guò)無(wú)盡的組合。但若換一個(gè)角度，將濾液視為一個(gè)整體，通過(guò)自上而下的操作干擾、簡(jiǎn)化它，或許能最大化提取關(guān)于轉(zhuǎn)移介質(zhì)的信息。從還原論轉(zhuǎn)向整體論，在導(dǎo)師Paul的鼓勵(lì)下，我重新開始了對(duì)這轉(zhuǎn)移介質(zhì)的搜尋，并在完全未知它的類群，甚至不知其是否算得上生命的情況下，逐步掌握了它的一些特性。例如，它在濾液中的濃度大概是每毫升105個(gè)，且被稀釋后，只要與SBW25菌共培養(yǎng)一輪，就總能恢復(fù)到這個(gè)濃度。

這些扎實(shí)而繁復(fù)的實(shí)驗(yàn)中積累的經(jīng)驗(yàn)，讓我開始習(xí)慣于研究黑箱中的對(duì)象，并指引我最終鎖定了這個(gè)介質(zhì)的真正身份。核心實(shí)驗(yàn)的思路是再基礎(chǔ)不過(guò)的“稀釋至滅絕”，也就是將能介導(dǎo)I55轉(zhuǎn)移的堆肥濾液沿著梯度不斷稀釋。由于此前已經(jīng)確認(rèn)有效介質(zhì)在經(jīng)過(guò)一輪擴(kuò)增后總能恢復(fù)到固定的濃度，因此沿著稀釋梯度的濾液經(jīng)擴(kuò)增會(huì)分成清晰的兩類：高于某個(gè)濃度閾值，有效介質(zhì)仍存在并能被擴(kuò)增，從而能介導(dǎo)I55轉(zhuǎn)移；低于這個(gè)閾值，有效介質(zhì)被稀釋掉，也就無(wú)法介導(dǎo)轉(zhuǎn)移。若是將這個(gè)閾值兩側(cè)的濾液進(jìn)行深度測(cè)序，那么那些存在且僅存在于能介導(dǎo)I55轉(zhuǎn)移的樣品中的序列，就幾乎一定是有效介質(zhì)的序列（或至少與它相關(guān)）。

等待測(cè)序結(jié)果返回的時(shí)光無(wú)比漫長(zhǎng)，直到2025年2月7日——我永遠(yuǎn)也忘不了那個(gè)冬日的傍晚——一段超過(guò)250 kb的長(zhǎng)序列赫然出現(xiàn)在從頭組裝的結(jié)果中。我迫不及待地BLAST查找它，發(fā)現(xiàn)相似序列都屬于“巨型噬菌體”——這便是我博士階段的Eureka時(shí)刻！不同于三年前發(fā)現(xiàn)I55時(shí)的無(wú)心插柳和后知后覺，此次我們幾乎瞬間就意識(shí)到了它的意義——“眾里尋他千百度”。

至此，轉(zhuǎn)移介質(zhì)已經(jīng)被明確鎖定到這個(gè)巨型噬菌體，我們將其命名為JPTI55，即“能協(xié)助I55轉(zhuǎn)移的巨型噬菌體”（Jumbo Phage Transducing I55）。但嚴(yán)格來(lái)講，上述實(shí)驗(yàn)只是證實(shí)了JPTI55和轉(zhuǎn)移具有強(qiáng)相關(guān)性，想要真正證明I55是借助JPTI55轉(zhuǎn)移的，還是要遵循還原論的思想，即從濾液中分離出JPTI55噬菌體。現(xiàn)在轉(zhuǎn)移介質(zhì)的身份從暗處轉(zhuǎn)為明處，分離的目標(biāo)就明確多了。由于巨型噬菌體在正常濃度的培養(yǎng)基中無(wú)法形成噬菌斑，我們查閱文獻(xiàn)，制定了專門富集巨型噬菌體的方案，很快就得到了純化的JPTI55，并驗(yàn)證了它確實(shí)能介導(dǎo)I55跨細(xì)菌轉(zhuǎn)移。后續(xù)我們還測(cè)序了JPTI55侵染攜帶I55的細(xì)菌后的衣殼，確認(rèn)I55是巨型噬菌體的“衛(wèi)星元件”（即通過(guò)劫持噬菌體來(lái)完成跨細(xì)菌傳播的可移動(dòng)遺傳原件），但這都屬于具體細(xì)節(jié)方面的補(bǔ)充了。最重要的毫無(wú)疑問(wèn)還是確認(rèn)轉(zhuǎn)移介質(zhì)的身份，自此研究路線就走上了快車道，半年內(nèi)就修稿重投PNAS并被順利接收。

結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)在，我已經(jīng)到了攻讀博士的收尾階段，借著撰寫畢業(yè)論文的契機(jī)，整體回顧這項(xiàng)工作，深感自己的幸運(yùn)——而且有兩次，即I55的發(fā)現(xiàn)和JPTI55的發(fā)現(xiàn)，分別確定了這幾年的研究對(duì)象、解釋了核心現(xiàn)象的機(jī)制。除了這兩個(gè)幸運(yùn)的瞬間，剩下的絕大多數(shù)時(shí)間都在養(yǎng)細(xì)菌、做克隆、鋪平板，但也樂(lè)在其中——科學(xué)的樂(lè)趣固然在于萬(wàn)般求索后的頓悟，但也在于用重復(fù)的、平凡的、扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)去測(cè)試每一個(gè)看似微不足道的假設(shè)，無(wú)論結(jié)果是否符合預(yù)期，它們都在不同程度上揭示了大自然的秘密。

實(shí)際上，我之所以享受這一研究過(guò)程，還有一個(gè)更深層次的原因。即便在許多人看來(lái)，這并非一個(gè)意義重大的課題，也談不上是“高明”的科學(xué)問(wèn)題，但以經(jīng)驗(yàn)主義的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)理解自然，本身就對(duì)我有強(qiáng)烈的吸引力。對(duì)我而言，這是不同于嚴(yán)格演繹的通往現(xiàn)實(shí)的另一條路徑，因?yàn)槲冶究剖菙?shù)學(xué)背景，這種科學(xué)發(fā)現(xiàn)的偶然以及假設(shè)的驗(yàn)證，讓我真正觸摸了自然世界。得到這樣的機(jī)會(huì)同樣來(lái)之不易，背后的支撐源自導(dǎo)師給我的極大的自由、慷慨的資助和必要的鼓勵(lì)，以及整個(gè)馬克斯·普朗克學(xué)會(huì)對(duì)“高風(fēng)險(xiǎn)”項(xiàng)目的支持——這些托底，才是享受過(guò)程、順其自然的底氣。

我們愛科學(xué)、做科學(xué)，固然要學(xué)習(xí)科學(xué)知識(shí)、采納科學(xué)方法，但歸根結(jié)底是要欣賞并接受科學(xué)所描述的自然——這種發(fā)自內(nèi)心的實(shí)事求是，才是我在博士訓(xùn)練中獲得的最本質(zhì)的收獲——甚至比發(fā)現(xiàn)巨型噬菌體衛(wèi)星這個(gè)成果本身更珍貴。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhao, Y.; Ma, Y.; Vasileiou, C.; Farr, A. D.; Rogers, D. W.; Rainey, P. B. Jumbo phage-mediated transduction of genomic islands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.2025. 122 (44) e2512465122. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.2512465122.

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